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qPCR-kaum eine exponentielle Phase, aber tolle Schmelzkurve
martin20992013-07-19 11:06:07
ProfilLiebe Leute,

bei meiner qPCR tut sich folgendes Problem auf: beta-Actin sollte eigentlich sehr stark in dem zu analysierenden Gewebe expremieren; beim run ist aber kaum eine Amplifikation zu erkennen bzw. nur sehr wenig; bei Betrachtung der Schmelzkurve geschah dann quasi ein Wunder: bei der zu erwartenden Temp ein schöner Peak; um sicher zu gehen trug ich das Produkt auf ein Gel auf; soll 279bp fette Bande ist bei 300bp zu sehen; war eigentlich sehr erfreut, aber weiß wer warum man keinen "starken" exponentiellen Anstieg sehen kann?
Danke schon mal für eure Hilfe!

lg
acribio2013-07-23 09:27:21
ProfilHallo,

ist es nicht so, dass für die Schmelzkurve SYBR Green als interkalierender Farbstoff zum Einsatz kommt, während bei der Amplifikation die Fluoreszenz der farbmarkierten Primer vermessen wird.

Daraus ergäbe sich für mich die einfache Erklärung, dass vielleicht irgendetwas mit den Primern nicht in Ordnung war. Also nicht der Primer selbst, aber die Farbmarkierung. Vielleicht war es ja auch der unmarkierte "normale" Primer. Das hätte glaub ich das gleiche Resultat.


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