| PCR Inverse und Nested klappt nicht |
| Knutschbacke | 2010-01-28 09:29:34 |
Profil | Hallo,
ich mache gerade meine Bachelorarbeit und weiß nicht so recht, wie ich weiterkommen soll. Ich schneide mit einem Restriktionsenzym eine Sequenz aus pflanzlicher genomischer DNA. Das klappt auch ganz gut, habe einen guten Schmier auf dem Gel, sodass man sieht, dass das Fragment in alle Größen kleingeschnitten worden ist. Anschließend führe ich eine Ligation durch, um dann davon eine Inverse PCR zu starten. Mit der Inversen PCR amplifiziert man ja aus einer bekannten Sequenz in eine unbekannte Sequenz hinein. Da ich aber nicht weiß, wie groß mein Fragment ist, was ich amplifizieren will ( und ich erwarte das es recht groß sein könnte), hab ich folgendes PCR Programm gewählt:
1. 94°C 5 Min
Zyklus:94°C 1 Min
Gradient 56°C und 60°C
| | Knutschbacke | 2010-01-28 09:38:33 |
Profil | ....ups, da lief was schief...hier der rest:
1. 94°C 5 min
2. 94°C 1 min
3. Gradient 56°C und 60°C 1 min
4. 72°C 5 min
...von punkt 2 bis 4 führe ich 25 zyklen durch, gebe dann erneut GoTaq-Polymerase hinzu und dann das gleiche Programm wieder 25 Zyklen und zum schluss position 5
5. 72°C 30 min
dann kühlen auf 4°C
insgesammt sind es also 50 zyklen, da ich erwarte ein großes fragment zu erhalten und meine konzentration an isolierter DNA auch nicht so groß ist...möchte ja viel produkt erhalten
nun zumProblem:
ganz blöd ist, dass ich kein produkt erhalte...bzw ich erhalte nur nen breiten schmier...
auch mit anderen primern erhalte ich immer das gleiche...meine taschen auf dem gel leuchten hell und freundlich, aber auf dem gel ist nix zu erkennen. die wasserprobe sieht genauso aus wie alle anderen proben....daher geh ich davon aus, dass es keine DNA, sondern einfach nur aufgrund der hohen zyklenzahl zu unspeziefischem wisch kommt...bitte helft mir.
vielen dank :) | | acribio | 2010-01-28 12:55:09 |
Profil | Hallo Knutschbacke,
willkommen im Forum
[quote]Anschließend führe ich eine Ligation durch, um dann davon eine Inverse PCR zu starten. [/quote]
?? Und der zweite Restriktionsverdau nach der Ligation?!?!?
[quote]Die wasserprobe sieht genauso aus wie alle anderen Proben...[/quote]
Ja das ist natürlich ein Problem. Erst wenn die Wasserprobe wirklich ohne Produkt ist, kannst du überhaupt eine Aussage treffen.
Das wären schon mal ein paar Hausaufgaben. Später erzähl ich noch bissle mehr zur PCR. | | Knutschbacke | 2010-01-28 18:35:39 |
Profil | Hallo,
wie der zweite Restriktionsverdau??? Ich schneide doch erst das Fragment aus meiner genomischen DNA und denn ligiere ich das, damit ich eine Art Plasmid habe.
Mit dem Plasmid mach ich dann die Inverse PCR, wo die Primer entgegen laufen und nicht aufeinander zu. Mit den Produkt aus der Inversen PCR möcht ich dann eine Nested PCR starten, aber soweit komme ich garnicht, da ich ja nicht mal in der Inversen PCR was definiertes rausbekomme (nur diesen Schmier).
Oder was hast du gemeint??
Lg :) | | acribio | 2010-01-28 20:30:10 |
Profil | also für den letzten Thread habe ich folgende Beschreibung zum Thema inverse PCR herausgesucht:
Wikipedia zum Thema inverse PCR: http://de.wikipedia.org/wiki/Inverse_Polymerase-Kettenreaktion
Du must dort den Zahlen 1. 2. und 3. folgen. Dort siehst du, dass bei einer inverse PCR nach der Ligation das "Plasmid" mit einem Restriktionsenzym geschnitten wird, wobei die Schnittstelle zwischen den beiden Bindestellen der Primer aus der bekannten Sequenz sein sollte!
Nach dem Schneiden hat man nämlich ein normales PCR-Template. Ganz aussen binden die Primer an den Enden mit bekannte Sequenz und können von der Polymerase in Richtung der unbekannten Sequenz prolongiert werden.
| | Knutschbacke | 2010-01-29 10:35:55 |
Profil | Hmm achso, ja gut ich habs ligiert gelassen, da auch mein Prof davon ausging, dass das auch so klappen müsste. Es ist ja im Grunde dasselbe, ob nun geschnitten oder ligiert oder nicht?? Die Primer binden doch trotzdem zu ihrer komplementären Sequenz und der Taq ist es doch egal, ob das Template geschnitten ist oder nicht...außerdem haben das Kollegen ebenso schon mit ungeschnittenen Template erfolgreich amplifiziert.
Hmm, meinste du, es ist unbedingt erforderlich das nochmal zu schneiden??
Liebe Grüße :) | | acribio | 2010-01-29 12:16:03 |
Profil | [quote]da auch mein Prof davon ausging, dass das auch so klappen müsste.[/quote] da hat er bzw. deine Kollegen recht! Ich habs glaub ich im vorigen Thread auch schon erwähnt, bzw. es wurde gefragt.
Der Restriktionsverdau bringt auch wieder neue Probleme (Reinigung, Verluste...).
Ja Nun also zu den wirklichen Problemen:
1.) Die Ligation muss natürlich klappen!! Hast du da einen Nachweis?
2.) PCR. Da gibts aber mehrere Punkte:
Wichtig, um den Schmier zurückzudrängen ist es, zu vermeiden, dass
Primer mit Taq-Polymerase in Kontakt kommt, wenn es die Möglichkeit gibt, dass Primer schon unspezifisch gebunden haben könnte. D. H. schon die ERSTE Taq-Zugabe habe ich immer erst bei Punkt 2 gemacht!! (Hot-Start)
Ganz wichtig ist immer wieder zwischen Taq-Polymerase und proof-reading-Polymerasen zu unterscheiden! In eurem Fall ist die Taq sicher angebracht (wenn man noch kein Fragment gesehen hat).
Die Taq-Polymerase hat eine enorme Geschwindigkeit von sage und schreibe ~20bp /Sekunde !
Proof-reading Polymerasen nur ca. 5-6bp/sek.
Man muss aber berücksichtigen, dass die Taq auch Fehler macht! (Also wenn es auf die Sequenz nachher
ankommt (zur Klonierung z.B.), dann sollte man auf proof-reading umschalten (und - wichtig: Das Programm
darauf abstimmen!)
In jedem Fall würde ich es als großen Fehler erachten eine Annealingzeit von 1min zu wählen!
Also Schritt 3. deiner PCR.
Die Taq-Polymerse hat in dieser Zeit im Durchschnitt bereits
60 Sekunden x 20 bp/Sekunde = 1200 bp durch!
Die minimal schlechtere Performance aufgrund der niedrigeren Temperatur ist hier vernachlässigt.
(das ist imho der Grundfehler bei 99,9% aller PCR-Programmen)
Von einem "Annealing" kann man da gar nicht sprechen!
diese Zeit würde ich x auf 15-25sek verringern (je nach Volumen der PCR; größere Volumina brauchen länger zum Abkühlen/Aufheizen)
Gadienten kannst dir sparen, nimm z. B. 42-45° Celsius und dann klappt wenigstens. Diese "hohen" Annealing-Temperaturen, "weil es ja möglichst spezifisch binden und keinen Schmier geben soll" ist Quatsch. Es binden ja selbst bei der Schmelztemperatur eines Primers nur ca. 50% vom Primer. Also ruhig unter die Schmelztemperatur gehen.
Nun zu PCR-Schritt 4.) 72°C 5min
Das ist ganz ordentlich lang. Das ist wahrscheinlich nicht verkehrt. Diese Zeit scheint mir allerdings eher für eine proof-reading-Polymerase geeignet!
Die Taq-Polymerase schafft in dieser Zeit:
5 x 60 sek/min x 20bp /sek = 6000 bp !! (für proof-reading ~1500bp)
Das kann natürlich beabsichtigt sein. Könnte durchaus sein, dass du so ein langes Produkt erhälst,
man könnte aber für die Taq auch weniger Zeit nehmen, das ist vermutlich egal.
Die Idee nach dem 25 Zyklus noch Polymerase dazu zu geben ist sicher gut gemeint.
Kannst vielleicht trotzdem mal weglassen, die Taq-Polymerasen halten ganz schön was aus.
Es ist so, dass die Taq-Polymerasen so ca. 3-4h min
bei 95°C aushalten und dann immer noch 75-80% Aktivität haben (meine ich; ohne Garantie)
die paar Minuten bei 72°C überstehen sie dann allemal. Aber so ein Enzym wird auch durch die Polymerisation an sich beansprucht. Also
verkehrt ist das sicher nicht.
So - ich hoffe ich konnte dir ein paar Tipps geben, die hilfreich waren.
Würd mich wirklich freuen, wenn du bald Produkte siehst ;)
lg
Acribio alias Michael | | Knutschbacke | 2010-01-29 18:32:46 |
Profil | Hmm, also das mit der Ligation ist sone Sache...weiß nicht so recht, wie man die nachweisen soll. Theoretisch könnte ich ja was aufs Gel auftragen, sehe da aber nicht besonders viel...zudem hatte mein Doktorand gesagt, da würde man auch nix sehen können...kein Plan.
er meinte auch, ich müsse nach dem Verdau keine Hitzeschockinkubation machen (weils bei ihm auch immer ohne geklappt hat)...hatte es heute trotzdem versucht, weil mein Enzym ja möglicherweise noch aktiv sein könnte und meine Ligation immer wieder ausseinander schneidet...also hab ich das heute versucht und danach eine PCR Inverse mit 25 µl Ansätzen (anstatt 50 µl) und "Hot Start"..ich dachte vielleicht, dass das mit diesen Sachen schon gut kappt...aber nix da. is mal wieder nix af dem Gel, nur Schmier. (Ich muss noch ergänzen, das der Schmier immer recht schwach ist, somit sieht das eigentlich nicht so aus, als ob da überhaupt irgendwas amplifizeiert wurde...würd am liebsten mal ein Bild hier hochladen)
Naja, mal gucken, am Montag versuch ich das nochmal mit den anderen Zeiten bei der PCR.
Danke und Liebe Grüße :)
| | acribio | 2010-01-29 22:15:05 |
Profil | Du kannst Bilder hier einbinden, aber nicht hochladen. |
