| Schneiden mit Restriktionsenzymen |
| Charly19 | 2009-10-04 17:34:22 |
Profil | Hallo,
hätte da drei Fragen bezüglich schneiden mit Restriktionsenzymen; ob das so stimmt was bei mir rauskommen würde
1.) "Schreiben sie die Sequenz an (5´- 3´) die entsteht wenn eine NcoI Site (5´- C/CATGG- 3´) mit NcoI geschnitten und anschließend mit Klenow aufgefüllt und religiert wird"
NcoI:
C/CATG G
G GTAC/C
Klenow heist:
* Auffüllen von 5'-überstehenden, einzelsträngigen DNA-Sequenzen nach Restriktionen
* Abbau von 3'-überstehenden, einzelsträngigen DNA-Sequenzen nach Restriktionen
Das heist es entstehen "blunt ends" (glatte Enden) ->
CCATG + G -> CCATGG
GGTAC + C -> GGTACC
2.) "Schreiben sie die DNA-Sequenzüberhänge (5´- 3´), die entstehen wenn DNA-Fragmente mit terminalen BamHI Schnittstellen (G/GATCC) geschnitten, mit Klenow aufgefüllt und anschließen in einen XhoI (C/TCGAG) gschnittenen und ebenfalls mit Klenow aufgefüllten Vektor ligiert wird. Wird zumindest eine der Schnittstellen wieder regeneriert, wenn ja welche?"
BamHI:
G/GATC C
C CTAG/G
XhoI:
C/TCGA G
G AGCT/C
->
GGTAC + G -> GGTACG
CCATG + C -> CCATGC
Es wird keine Schnittstelle religiert!
3.) Wie berechnet man die Ligationseffizien?
Keine Ahnung ob das stimm was ich da fabriziere, hoffe es findet sich jemand der helfen kann.
Gruß
Charly | | acribio | 2009-10-05 13:32:59 |
Profil | Hallo Charly,
puh ich hab ganz schön lange gebraucht, bis man deine Postings erstmal lesen konnte. Tut mir leid, die Forensoftware hat seit der Umstellung von php3 auf php4 enorm viele Macken. Vielleicht werd ich mal ein "richtiges" Forum installieren (aber dann wirds sicher langweilig).
zu 1.) NEIN!
NcoI:
5'-C^C A T G G-3'
3'-G G T A C^C-5'
C / CATGG -> CCATG CATGG -> CCATGCATGG
GGTAC / C -> GGTAC GTACC -> GGTACGTACC
Was an der einen Seite (oben) das 3' ende ist, ist am anderen Ende
oben das 5' ende ABER UNTEN (komplementär) wieder das 3' Ende.
Die Polymerase-Aktivität des Klenow-Fragmenst würde BEIDE Enden auffüllen.
http://de.wikipedia.org/wiki/Klenow-Fragment
Die 3'-5' Exonuklease-Aktivität tritt erst in Aktion, wenn das Schnittmuster "andersrum" ist also z. B. :
5'-C C A T G^G-3'
3'-G^G T A C C-5'
dann würde folgendes passieren (keine Ahnung ob es so ein Enzym gibt):
5'-C C A T G / G-3' -> 5'-C G-3' ->5'-C-G-3'
3'-G / G T A C C-5' -> 3'-G C-5' -> 3'-G-C-5'
Hier wiederum schneidet die Exonuklease-Aktivität des Klenow-Fragments BEIDE Enden zu Blunt-Enden.
| | acribio | 2009-10-05 14:00:28 |
Profil | BamHI:
vektor-BamHI-Insert-BamHI-Vektor
------------------------------------/
1. BamHI, 2. Klenow:
vektor-G/GATC C-Insert-G/GATC C-vektor 2.-> vektor-GCTAG GATCC-Insert-GGATC GATCC-vektor
vektor-C CTAG/G-Insert-C CTAG/G-vektor 2.-> vektor-CCTAG CTAGG-Insert-CCTAG CTAGG-vektor
andere Vektor mit XhoI-Site:
vektor-XhoI-Vektor
-----------------/
vektor-C/TCGA G-vektor
vektor-G AGCT/C-vektor
1. XhoI 2. Klenow:
vektor-CTCGA TCGAG-vektor
vektor-GAGCT AGCTC-vektor
Jetzt Ligation
vektorXhoIaufgefüllt + BamHIaufgefüllt-Insert-BamHIaufgefüllt + XhoIaufgefüllt-vektor
----------------------------------------------------------------------------------------------------/
vektor-CTCGA TCGAG-vektor + GATCC-Insert-GGATC
vektor-GAGCT AGCTC-vektor + CTAGG-Insert-CCTAG
=>
vektor-CTCGA + GATCC-Insert-GGATC + TCGAG-vektor
vektor-GAGCT + CTAGG-Insert-CCTAG + AGCTC-vektor
Ligation
=>
vektor-CTCGAGATCC-Insert-GGATCTCGAG-vektor
vektor-GAGCTCTAGG-Insert-CCTAGAGCTC-vektor
Na? Welche Schnittstelle ist jetzt "entstanden"?
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