Proteine |
| Molinchen | 2008-11-16 16:59:09 |
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Beitrag #1 • | Hallo!
Ich habe einige Fragen zum Thema Proteine und Biochemische Arbeitsmethoden, vielleicht kann mir jemand weiterhelfen?
1. Was versteht man unter Spezifität einer Protease?
2. Wie können Proteasen-Inhibitoren wirken?
3. Was ist eine katalytische Triade?
4. Welche Funktion hat das SDS und welche das Mercaptoethanol bei der Elektrophorese?
5. Nach welcher Eigenschaft werden Proteine bei einer SDS-PAGE aufgetrennt?
6. Aus welchen beiden Versuchsteilen besteht ein Western-Blot?
7. Warum entsteht bei einem Western-Blot nur an einer Stelle der unlösliche und somit sichtbare Farbstoff, wo das nachzuweisende Protein vorliegt?
Bitte hilft mir=(
| | acribio | 2008-11-16 20:48:08 |
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Beitrag #2 • | Hallo Mollinchen,
Willkommen im Forum! Deine Fragen sind ja knapp und präzise, ich hoffe ich kann meine Antworten auch so gestalten :~
1.) Was versteht man unter Spezifität einer Protease?
Das ist natürlich die Aminosäure-Sequenz, die die Protease angreift, bzw. wie diese Sequenz beschaffen sein muss, damit die Protease spaltet.
Es gibt unspezifischere Proteasen, die werden im Magen-Darm-Trakt benötigt, und sollen öfter spalten, damit kleine Bruchstücke herauskommen. Chymotrypsin oder Trypsin wären ein Beispiele dafür (Serin-Proteasen).
Thrypsin http://de.wikipedia.org/wiki/Trypsin
| Zitat: Anders als bei den meisten Enzymen sind Proteinasen nicht auf bestimmte Eiweiße spezialisiert, sondern auf bestimmte Strukturmerkmale von Eiweißen - das ist insbesondere für den Verdauungsvorgang wichtig... |
|
-> soll heissen, die sind unspezifisch.
Es gibt aber auch "spezifischere" Proteasen, die seltene Sequenzen angreifen, das sind oft Serin-Proteasen. (Die heissen so, weil im aktiven Zentrum der Protease ein Serin hängt, nicht etwa, weil die bei einem Serin spalten...)
Die "Spezifität" kann soweit gehen, dass eine Protease nur noch seeehr wenige Proteine spaltet. Das eignet sich dann nicht zur Verdauung, aber z. B. als SIGNAL ! Die Biologie hat nämlich erkannt, dass man diese Verdauungsenzyme auch hervorragend für die Signaltransduktion einsetzen kann (Signalpeptidasen). Einige haben sogar gleich mehrere Funktionen (z.B.in anderen Organen, z.B. ZNS!).
Thrombin z. B. ist eine Peptidase, die Fibrinogen zu Fibrin spaltet
Sie ist damit SPEZIFISCH für Fibrinogen.
http://de.wikipedia.org/wiki/Thrombin - wichtig für Blutgerinnung
| | acribio | 2008-11-16 20:54:52 |
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Beitrag #3 • | 2.)Wie können Proteasen-Inhibitoren wirken?
Protease-Inhibitoren inhibieren Proteasen :D
Nun: Protease-Inhibitoren sind der Erkennungssequenz der Protease seeeehr ähnlich (eine Art Molekül-Mimikry). Sie können aber (z.B.) nicht gespalten werden bzw. blockieren das Enzym. Sie können extrem hohe Affinität zur Protease haben. Die Protease ist damit wirkungslos. einige Viren bedienen sich dieses Tricks. | | acribio | 2008-11-16 21:06:55 |
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Beitrag #4 • | 3. Was ist eine katalytische Triade?
Puh da fragst du was. Ich hab mal nachgeschaut:
Reaktionsmechanismus einer Serinprotease
Es handelt sich um die spezielle Anordnung im aktiven Zentrums der Protease. (siehe Reaktion links oben im obigen Link)
Im Aktiven Zentrum der Protease befindet sich ein Serin, ein Histidin und ein Aspartat, die alle zusammen wirken (katalytische Triade). Intermediär wird jetzt ein Teil des zu spaltenden Proteins an das Serin-OH gekoppelt (oberer beschrifteter Pfeil) und diese Bindung dann
später wieder hydrolisiert (unterer beschrifteter Pfeil)
http://de.wikipedia.org/wiki/Katalytische_Triade
| | acribio | 2008-11-16 21:22:51 |
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Beitrag #5 • | 4) Welche Funktion hat das SDS und welche das Mercaptoethanol bei der Elektrophorese?
SDS soll das Protein komplett "aufdröseln", d.h. es die Proteine werden in ihrer Sekundärstruktur/Tertiärstruktur aufgelöst, nur noch der Proteinstrang bleibt erhalten.
Zusätzlich lagert sich das SDS in H2O um das Protein, ähnlich wie auch z. B. Schmutz von Waschmittel gelöst bzw. solubilisiert wird.
Die Proteine sind nicht mehr kugelförmig, sonder linear. Die Wanderungsgeschwindigkeit im Gel ist deshalb leichter zur Länge der Proteine in Beziehung zu setzen
Zusätzlich passiert Folgendes: Da die Anzahl der nötigen SDS-Moleküle zur Umhüllung des Proteins ungefähr proportional zur Größe des Proteins ist, ist auch die Ladung des neuen Komplexes proportional zur Größe des Proteins! Große Proteine tragen mehr Ladung, was für die Migration im Gel wichtig ist. Ohne SDS reicht die Ladung der Proteine kaum aus.
Wozu noch das Mercaptoethanol?
Es löst Disulfid-Brückenbindungen auf und zerstört damit die Quartärstruktur.
| | acribio | 2008-11-16 21:28:08 |
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Beitrag #6 • | 5. Nach welcher Eigenschaft werden Proteine bei einer SDS-PAGE aufgetrennt?
Die Proteine werden in etwa nach der Länge, d.h. Anzahl der Aminosäuren bzw. nach Molekulargewicht aufgetrennt. (üblicherweise in KiloDalton angegeben)
Wenn man natürlich besondere Proteine hat, die eine ungewöhnliche
Ladungsverteilung haben, z. B. extrem viel saure Gruppen mit negativer Ladung tragen, dann können solche Proteine "wo anders" "laufen"
und ein verändertes Molekulargewicht vortäuschen.
| | acribio | 2008-11-16 21:56:22 |
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Beitrag #7 • | 6. Aus welchen beiden Versuchsteilen besteht ein Western-Blot?
Hm (stirnrunzel)
Fangen wir lieber vorne an:
Am Anfang steht die SDS-Gelektrophorese: Die Proteine werden nach Größe aufgetrennt und befinden sich nun im Gel. (Dieser Schritt ist hier vermutlich nicht gemeint)
Bei einem Western-Blot wird nun folgendes durchgeführt:
I.) Es wird "geblottet"
Damit ist die Übertragung der Proteine aus dem Gel auf einen folienartigen Träger gemeint. Das Gel wird auf eine Folie/Membrane gelegt und die Proteine mit Strom auf die Membran übertragen.
II.) Die Inkubation des Blots (die Membran mit den Proteinen) mit dem entsprechenden Antikörper gegen das zu untersuchende Protein.
Zusätzlich muss der überschüssige und unspezifisch gebundene Antikörter in Waschungen entfernt werden.
III.) Die Färbereaktion. Diese kann recht unterschiedlich ausfallen. Oft ist es ein zweiter Antikörper, der an den ersten bindet und dann eine chemische Färbereaktion katalysieren kann.
Deine zwei Schritte, das kann jetzt vieles sein:
II und III sind eventuell ein Schritt,
oder aber: Schritt I fällt auch noch weg.
| | acribio | 2008-11-16 22:01:25 |
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Beitrag #8 • | 7. Warum entsteht bei einem Western-Blot nur an einer Stelle der unlösliche und somit sichtbare Farbstoff, wo das nachzuweisende Protein vorliegt?
Wenn du die Antwort zu Sechstens gelesen hast, dann ist das jetzt einfach:
Auf der Membran sind zwar viele Proteine, aber in einer Inkubation/Reaktion bindet ein spezifischer Antikörper an das zu untersuchende Protein. In der anschliessenden Färbereaktion wird nur noch dieser Antikörper angefärbt.
Ich hoffe ich konnte dir helfen ;)
| | Fiorella | 2008-12-11 11:34:13 |
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Beitrag #9 • | Hallo!
Ich befinde mich in der glücklichen Lage bald Protein Chemie Prüfung zu haben. Unser Prof hat es uns leicht machen wollen und uns die Fragen 1 Woche früher überreicht. Dafür sind sie um einiges schwieriger als ich mir erwartet habe, ich hoffe ihr könnt mir helfen:
During process development the Bradford protein assay with BSA (bovine serum albumin) as a standard has been used for protein quantification. Final formulation has been determined to contain 0,1% Tween80 and sucrose. The potency of the product will be determined by the protein assay.
Questions:
1.) Is the Bradford protein assay still applicable?
--tween ist ein "detergent" und in der Konzentration zu hoch um keinen Einfluss auf Bradford zu haben. Also nein,..man muss einen andern nehmen,..soweit so gut
2.) Which protein determination do you suggest?
--BCA wurde in einen Bradford protein assay vorgeschlagen, weil der keinen Einfluss auf "detergents" hat. Andere Vorschläge?
3.) Is BSA as a standard appropriate for accurate protein quantification?
--Wenn die "Reinheit" Standard die gleiche von der Probe ist ja, ansonsten nein, generell gesagt is BSA kein guter Standard, besser wäre IgG der auch kommerziell erhältlich ist. Andere Vorschläge?
4.) Which standard will you use for protein quantification?
--siehe Frage 3
5.) How will you compare the old Bradford results with the results from your new method?
--Die fand ich besonders schwierig, möglich wäre beide Assays also Bradford und BCA mit dem "Goldstandard" Quantitative Amino Acid Assay zu eichen und dann eventuelle Messunterschiede zu vergleichen, aber ich bin mir da echt nicht sicher...
6.) When is it applicable to use the protein assay as a potency test?
--Hmm,..die find ich auch nicht leicht, vor allem welcher protein assay könnte gemeint sein? Nehmen wir einen ELISA an und nehmen wir and das Impfstoffe auf "da sein, oder nicht da sein" analysiert werden, dann kann das auch durchaus ein potency test sein?? Also es würde dann gelten, wenn die Struktur des Proteins teil der potency ist???????
Vielen Dank für jeden Hinweis oder Lösung einiger Fragen!!
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