Hallo Gast! - Einloggen - Anmelden
Alle Foren - PCR

Komische Bande, die keinen Sinn macht...

Kathrin2015-06-16 15:51:30

Profil

Beitrag #1
Hallo,
Ich habe ein Problem bei meiner PCR. Ich habe eine Negativkontrolle und 3 Proben benutzt. Für die Negativkontrolle wurde der gleiche Ansatz verwendet, aber nuklease-freies Wasser statt DNA zugegeben.
Nun habe ich das Problem, dass ich in der Negativkontrolle eine Bande der erwarteten Größe habe, aber in zwei meiner Proben nicht.
Ich habe schon an mir gezweifelt und gedacht, ich hätte die Proben vertauscht. Aber ich habe selber alles nochmal gemacht und ein Kollege unabhängig auch nochmal. Ich habe auch alle Materialien nochmal neu gemacht. Und wieder das gleiche Problem.
Vllt kann mir ja jemand von euch helfen. Vielen Dank schonmal!
acribio2015-06-17 10:16:09

Profil

Beitrag #2
Hallo Kathrin,

willkommen im Forum!
Positive Negativ-Kontrollen
xD
das scheinen mir eigentlich keine komischen Banden zu sein, die keinen Sinn machen...

erste schnelle Antwort:
Du musst zuerst alle Fehler beheben, bis Du keine positiven Banden mehr in den negativ-Kontrollen hast!

Das hört sich wenig hilfreich an, ist aber so. Ich höre aus den "komischen Banden" den Funken Hoffnung, dass es was anderes als Dein eigentliches PCR-Produkt ist, und du nicht so schlampig gearbeitet hast. Mach dir aber keine Illusionen. Du musst in allem was Du in die PCR hineinpippetierst, wie auch die Materialien, die Du verwendest (Pipetten!! Tubes, das ganze Labor... etc.) das Template vermuten. Gegenstände und Lösungen von DNA zu dekontaminieren ist noch schwieriger als zu sterilisieren!
acribio2015-06-17 10:27:21

Profil

Beitrag #3
- Pipetten kann man autoklavieren.
Das macht man zu selten, aber wenn die Pipetten kontaminiert sind, dann wäre das eine beständige Fehlerquelle, mit Deinem obigen Ergebnis. Autoklavierte DNA ist möglicherweise immer noch nicht weg, aber es ist besser als nix (genauer, eine der häufigsten Fehlerquellen dieser Art)

Alle Lösungen inklusive der Polymerase stehen ab jetzt unter Verdacht:
Alle Lösungen müssen neu angesetzt (möglichst gleich mit sauberen Pipetten!!) und am besten aliquotiert werden. Sonst schleppt sich die DNA immer weiter... Also Primer, dNTPs neu verdünnen (eventuell sogar neu kaufen!! inklusive einer neuen Taq.
Autoklavierte Pipettenspitzen verwenden.
Pipettieren am besten unter einer Hood. Also so eine Pipettier-Haube.
Natürlich nicht dort, wo die Bakterien mit dem Template-Plasmid kultiviert werden(!!, dann lieber auf einer offenen Laborbank...)

Last but not least: Eventuell kann auch das PCR-Programm inklusive der Pipettierprozedur unspezifische DNA-Amplifikation begünstigen (niedrige Signal-Noise-ratio).





Beiträge 1 bis 3 von 3 angezeigt.

Zum Thema antworten

Kontakt | Partner | Impressum  © 2015  Acribio