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PCR ohne Primer

Key1232013-06-27 22:24:19

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Beitrag #1
Hallo!
Das hört sich jetzt einfacher an als es ist... Wir haben im Praktikum eine DNA-Synthese auf einzelsträngiger DNA Matritze (vom Bakteriophagen ΦX174) durchgeführt. Beim ersten Ansatz (s.u.) wurden dabei keinerlei Primer zugegeben. Trotzdem befindet sich im Agarosegel über der Bande der ursprünglichen DNA eine Schmier nach oben. Es muss also zu Reaktionen gekommen sein, so dass größere Moleküle entstanden sind. Wieso? Ich habe keine logische Erklärung dafür. Können sich dNTPs evtl einfach unspezifisch durch Entropiegewinn anlagern? Arbeitet das verwendete Klenow-Fragment unspezifisch im Ansatz? Konjungieren die dNTPs mit den Magnesiumionen? Ich habe keine Ahnung. Es wäre echt cool wenn hier jemand eine Theorie dazu hätte. Unser Praktikumsbetreuer hat darauf hin gewiesen, das es eine sinnvolle Erklärung dafür gibt, die nichts mit Verunreinigung zu tun hat. Vielen Dank schonmal im Voraus! Hoffentlich sind alle Infos dabei...

Ansatz: Tris/HCl, MgCl2, NaCl, ssΦX174DNA, H2O, DTT, dNTPs, Klenow-Fragment
also alles was ein PCR-Ansatz braucht.. außer den Primern
acribio2013-06-28 11:34:45

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Beitrag #2
http://de.wikipedia.org/wiki/Klenow-Fragment

vielleicht liegt hier der Schlüssel:

Das Klenow-Fragment war das ursprüngliche Enzym, welches für die Amplifizierung von DNA mittels PCR verwendet wurde, bevor es durch thermostabile DNA-Polymerasen, wie die Taq-Polymerase, ersetzt wurde.

- Auffüllen von 5'-überstehenden, einzelsträngigen DNA-Sequenzen nach Restriktionen (Polymerasefunktion)
- Abbau von 3'-überstehenden, einzelsträngigen DNA-Sequenzen nach Restriktionen (Exonukleasefunktion)
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