Schmelzkurvenanalyse |
| FrauBlume | 2011-12-09 10:07:49 |
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Beitrag #1 • | Ich brauch nochmal euren Rat, bin Anfänger :) Also wenn ich eine Schmelzkurvenanalyse nach der RealtimePCR mache, dann bekomme ich ja im Idealfall einen schönen Peak der mir sagen soll, ob ich da auch wirklich mein Produkt habe... wenn ich primerdimere habe, liegen die ja so um die 70°C oder? Aber wenn ich einen Peak um die 80°C habe, wieso sagt mir das, dass ich da mein spezifisches Produkt habe?? Wie kann ich denn den Schmelzpunkt von meinem Produkt ausrechenen? über die formeln für Primer gehts ja anscheinend nicht :) Wäre toll wenn mir das jemand erklären kann! Danke :) | | acribio | 2011-12-10 19:31:26 |
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Beitrag #2 • | Hallo Frau Blume,
zuerstmal ein Link über Realtime PCR:
http://de.wikipedia.org/wiki/Real_time_quantitative_PCR dort steht (gleich unter "interkalierende Farbstoffe":
| Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird die DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50 °C ? 95 °C). Bei einer für das Fragment spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der Doppelstrang zu zwei einzelsträngigen Molekülen. Dabei wird ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green I) freigesetzt und eine Fluoreszenzabnahme registriert. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung möglich. Die Höhe des Peaks der Schmelzkurve gibt annähernd Auskunft über die Menge des gebildeten Fragments. |
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>Wie kann ich denn den Schmelzpunkt von meinem Produkt ausrechenen?
Hier:
http://de.wikipedia.org/wiki/Primer
Sind insgesamt drei verschiedene Formeln angegeben. Aus der ersten Tm = 2( A + T ) + 4( G + C ) erkennst du, dass die Basenabfolge einen
entscheidenden Einfluss auf den Schmelzpunkt hat. Da die GC Bindung wesentlich stärker ist, geht die Anzahl dieser Paarungen stärker gewichtet (vier statt zweimal) in
den Schmelzpunkt ein. Was auch klar ist, dass diese Formel nur für kurze Fragmente was taugt und ansonsten eine Näherung ist,
denn mit 20 GC-Paarungen und 20 AT-Paarungen würde man bereits einen Schmelzpunkt von 40 + 80 = 120°C erhalten.
Bei 100°C sind aber Doppelstränge von der Länge von ganzen Chromosomen denaturiert,
Der Anstieg der Schmelztemperatur mit der Fragmentlänge wird also bei größeren Fragmenten immer unbedeutender.
Hier:
http://biophysics.idtdna.com/
kannst Du Deine Sequenzen eingeben, und schauen, wann die Stränge denaturieren. Kannst ja z. B. mal die Sequenz nehmen und zum Vergleich
die Primer nehmen, und insbesondere die Primersequenzen beider Primer direkt aneinanderhängen, als Dimer eben.
Primersoftware online:
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
Weiteres zum Thema Tm:
http://www.owczarzy.net/tm.htm | | Beiträge 1 bis 2 von 2 angezeigt. |
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