Unförmige PCR-Kurven

Unförmige PCR-Kurven
edinski	2011-11-28 17:02:37
Profil Beitrag #1 •	Hallo zusammen, ich hab gestern eine real-time PCR durchgeführt und mich etwas über den Verlauf meiner Kurven gewundert. http://www.fotos-hochladen.net/view/unbenannttx4l29rnwq.jpg Amplifiziert wurde das Gen GAPDH unter bereits optimierten Bedingungen. Verwendet wurde der Farbstoff Sybr Green. Wie kann es sein, dass die Fluoreszenzintensität mit zunehmender Zyklenzahl abnimmt? Was kann die Ursache dafür sein? Vielleicht hat jemand schon einmal das gleiche Problem gehabt. Grüße
acribio	2011-12-02 15:05:32
Profil Beitrag #2 •	keine Ahnung :-(
BeckerFollmann	2012-02-22 20:34:27
Profil Beitrag #3 •	Hallo, ich schätze mal folgendes die Kurven Zittern, wenn Du die Messtemperatur für die SYBR-Green Detektion nahe der Schmelztemperatur des Amplikons fährst (gut ne!). Insbesondere gegen Ende des PCR verschieben sich dann die Ionenverhältnisse so ungünstig, dass der DNA-Doppelstrang nicht immer stabil bleibt, SYBR-Green freigegeben wird und ein niedrigere Messwert entsteht. Das sollte verschwinden, wenn Du den SYBR-Green Messpunkt auf z. B. 65 oder 60 °C legst. Ich schätze, dann sind die Kurven wieder gerade. PS.: Die No template control fehlt oder? Gruss JBF
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