welche Annealingtemp. bei verschiedenen Primern? |
| FrauBlume | 2011-11-28 14:39:41 |
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Beitrag #1 • | Hi ihr Lieben, ich hab mal eine Frage... wir wollen eine Realtime PCR machen und verschiedene Primerpaare vergleichen, die alle ein ähnliches Produkt amplifizieren.. zumindest auf dem gleichen Gen. Wir wollen in jedem Well ein anderes Paar testen. Jetzt gibts aber das Problem, dass die Tm der Primer zwischen 50 und 67 °C liegen.. unsere Maschine kann aber keinen Gradienten sondern nur eine Temperatur... habt ihr eine Idee, welche Annealingtemp. wir da nehmen sollen? Ich hatte irgendwo gelesen, dass es egal ist, welche Schmelztemperaturen die Primer haben und das man immer 45°C nehmen kann, weil keine Nebenprodukten entstehen sollten, wenn man das gewünschte Produkt bekommt.. stimmt das? Danke für eure Hilfe! | | acribio | 2011-12-02 15:02:36 |
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Beitrag #2 • | Ja genau. Meiner Meinung nach ist es der falsche Weg über die Annealing Temperatur die Spezifität zu erhöhen. Wichtiger halte ich die vermeidung von Produkten vor dem ersten Denaturierungsschritt. Das erreicht man nur durch Zugabe der Polymerase bei 95°C. Deshalb halte ich auch Gradienten-PCR Blöcke für einen falschen Ansatz.
Oft ist auch die Extensiontime viel zu lang (meist 1min). Bei der Taq-Polymerase reichen 60sek für 1200bp. Diese Zeit reicht bei einem Produkt von 200bp Länge gleich für 6 Durchläufe der Polymerase.
Der / die Primer können ruhig höhere Schmelztemperaturen haben und sollten nicht zu kurz sein. DAS erhöht die Spezifität. Wenn die Schmelztemperatur dann bei 70-90°C liegt kann man trotzdem bei 45-50 Grad annealen, dann binden die Primer wenigstens vollständig.
Fazit: 23-28bp Primer nehmen, niedrige Annealingtemperaturen, sehr kurze Extension-Zeiten, die genau berechnet sind und mehr Zyklen nehmen (bis zu 45 z. B.) dann klappts. Wenn man Nebenprodukte hat: Sauberer arbeiten, dNTPs, Primer, steriles Wasser gut aliquotieren, PCR-Haube, Polymerase erst nach dem 1. Denaturierungsschritt zugeben.
Viel Erfolg
| | FrauBlume | 2011-12-05 10:05:16 |
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Beitrag #3 • | super danke dir!! ein paar Fragen hab ich noch: Meinst du, ich soll die Extensiontime genau berechnen, so dass ich quasi die genaue sekundenzahl für die Länge des Produktes berechne? oder soll es ruhig mehrere Durchgänge geben können? also wenn ich zb ein stück von 1200bp habe, dann nur genau 60sek?
und das mit den 45°C annealing kann ich logisch irgendwie noch nicht ganz nachvollziehen...mag mir jemand den hintergrund dabei nochmal genau erklären? binden die primer dann nicht unspezifisch oder machen sekundärstrukturen? | | acribio | 2012-01-02 18:21:46 |
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Beitrag #4 • | >die Extensiontime genau berechnen,
ja, also für ein Stück von 1200bp 1.5 min =90sek (denn 90sek x 20bp/sek = 1800bp)
das sollte für auf jeden Fall für einen Durchgang reichen und nicht für zwei.
>binden die primer dann nicht unspezifisch oder machen sekundärstrukturen?
Sekundärstrukturen?: Ja - aber der Vorteil, dass die Primer auch an der richtigen Stelle besser binden überwiegt und steigert an dieser Stelle enorm die Ausbeute. Diese Nebenprodukte sollte man dadurch verhindern, dass die Annealingtemperatur eben NICHT so lange ist (also auf keinen Fall 1min!), dass an dieser Stelle viel Produkt entsteht. Kürzeste Annealingzeit kann 7sek! sein (Lightcyclerkapillaren im Lightcycler). Ich habe meist 15sek genommen.
| | acribio | 2012-01-02 18:41:06 |
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Beitrag #5 • | >das mit den 45°C annealing kann ich logisch irgendwie noch nicht ganz nachvollziehen
Wenn ein Primer eine Schmelztemperatur von 55°C hat, und ich stelle die Annealingtemperatur auch auf 55 °C, dann bindet beim Annealing doch nur 50% des Primers, laut Definition des Schmelzpunktes eines Primers.
Also: weiter herunter mit der Temperatur. Am Besten gleich 10°C, und / oder Schmelzpunkt herauf ->70-90°) .
Und:
Was mache ich, wenn ich zwei Primer mit sehr unterschiedlichen Schmelzpunkten habe? Ist logisch, dass man mit der Annealing-Temp unter den niedrigsten Schmelzpunkt gehen sollte. Die praktische Erfahrung zeigt hier, dass durch den Primer mit höherem Schmelzpunkt nie mehr Probleme bzw. Nebenprodukte auftauchen. Deshalb: Hohe Schmelzpunkt und niedrige Annealing-Temp => keine Probleme
aber niedriger Schmelzpunkt und "herantasten" der Annealing-Temperatur an den selbigen... =>Probleme | | BeckerFollmann | 2012-02-21 22:43:45 |
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Beitrag #6 • | Ich gehe immer folgendermaßen vor:
Berechnung der Schmelztemperatur mittels z. B. "oligoanalyzer". Dann setzte ich ein Touch Down PCR auf mit Annealing-Temperaturen von +5 °C über der höchsten Schmelztemperatur bis etwa -5°C unter der niedrigsten Schmelztemperatur. Das können dann schon mal 10 °C Unterschied sein.
Die erwähnte Zugabe von TAQ-Polymerase bei 95 °C (Hotstart-PCR) führe ich immer durch, HotStart-Polymerase ist ja nicht mehr so teuer.
Die Extension-Zeit halten wir grundsätzlich bei 30 Sekunden und hat meiner Meinung nach keinen Einfluss auf die Spezifität des Produktes. Wichtiger ist eher noch die Konzentration der Primer und des Magnesiums, auch wenn mit Sonden gearbeitet werden sollte, soll das PCR Produkt spezifisch sein.
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