cDNA ohne RNAse Behandlung für semiquantitative RT-PCR? |
| Nadja | 2011-11-22 20:48:06 |
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Beitrag #1 • | Hi,
ich mache eine semiquantitative RT-PCR, dafür verwende ich first strand cDNA als template in meiner PCR mit Transkript-spezifischen Primern.
Die reverse Transkriptase, die ich verwende hat keine RNAse Aktivität, also ist mein template ja cDNA-RNA-Hybride, was an sich kein Problem zu sein scheint, da die PCR ja funktioniert. Nun frage ich mich, ob die Denaturierung (10s, 95°) eigentlich diese Hybride überhaupt wirklich effizient trennt oder ob meine Quantifizierung dadurch verfälscht sein könnte, weil ich in der Probe wo ich mehr mRNA habe ja dann auch dem entsprechend mehr Hybride habe?
Leider habe ich nicht daran gedacht, meine cDNA mit RNAse zu behandeln oder spielt das auch keine Rolle?
Danke. | | acribio | 2011-12-02 14:49:48 |
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Beitrag #2 • | Ich hab davon jetzt nicht mehr soo die Ahnung, aber ich glaube, dass Deine Sorge unbegründet ist und eine RNAse Behandlung vor der PCR
nicht nötig ist.
Ich glaube, dass die hitzestabile DNA-Polymerase eine RNAse Aktivität besitzt.
Deshalb werden Deine RNA template Stränge trotzdem abgebaut. Zwar nicht von der reversen Transscriptase, so aber von der Polymerase.
Sicher bin ich aber nicht! | | Beiträge 1 bis 2 von 2 angezeigt. |
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