RT-PCR Problem |
| winston | 2011-06-25 10:36:04 |
Profil
Beitrag #1 • | Hallo,
seit einiger Zeit versuche ich schon aus -RNA zwei Matrixmetallproteinasen zu isolieren.
Die PCR klappt aber überhaupt nicht. Habe schon verschiedenste template mengen von 250 ng - 1000 ng ausprobiert und die Annealing Temperatur zwischen 55 und 60 Grad variiert. Auch eine Touchdown PCR war nicht .
Der Versuch zuerst ein cDNA Transkript zu erstellen und eine normale PCR zu machen hat auch nicht geklappt.
Hat irgendjemand vielleicht noch weiter Ideen?
Vielen Dank
| | acribio | 2011-06-27 09:48:58 |
Profil
Beitrag #2 • | klappt denn ein Kontrollgen?!?
Was ist denn bei dir die Erstere, nicht normale PCR? Soetwas wie eine cDNA-Synthese und anschließende PCR in einem Schritt?
So als erster Tipp:
Die Annealing Temperatur erscheint mir viel zu hoch.
Das ist die Volkskrankheit Nr. 1: Berechnen einer Annealing Temperatur, um die Spezifität hoch zu halten. Dabei sinkt die Ausbeute enorm, denn PCR ist gar nicht mal soo sensitiv, wie man denkt.
Um die Spezifität hoch zu halten würde ich immer Hot-Start machen, d. h. die Taq Polymerase (keine andere nehmen!) erst nach 3-4 sek. des ersten 95 °C Denaturierungsschritts zugeben.
Ebenso wichtig: 1. AnnealingZeit kurz, d. h. nur 15 sek. maximal, je nach Volumen der PCR.
Annealing Temperatur: 42-45°C (nicht höher)
Und dann noch die Berechnung der Extension Time:
Länge des PCR-Produkts in bp dividiert durch etwa 20bp/sek für die Taq-Polymerase. Da kommt oft etwas erstaunlich anderes, als bei einer "normalen" PCR heraus, Beispiel: Für 100bp reichen 5 sek!
Letzter Tipp: Am Besten nur kurze PCR Stücke probieren, wenn es nicht klappt, also so 100, 150 oder 200 bp!
(15 sek. Extension reichen dann)
und als allerallerletzten Tipp:
Zahl der Zyklen auf >40erhöhen
| | Daniela | 2011-12-22 01:03:23 |
Profil
Beitrag #3 • | Acribio, könntest du mir ganz kurz erklären, wann und wofür ein RT-PCR verwendet wird ? RT steht doch für real time ?
DANKE
:)
| | acribio | 2011-12-22 10:59:25 |
Profil
Beitrag #4 • | Hallo Daniela,
das RT in RT-PCR steht in diesem Fall NICHT für realtime!!
Es steht für Reverse Transcriptase PCR.
Damit ist gemeint, dass zuerst mittels einer Reversen Transcriptase aus einer RNA-Präparation die messenger-RNAs (mRNAs), komplementäre cDNA synthetisiert wird. Die cDNA enthält die Gesamtheit aller synthetisierten mRNAs. Diese cDNA wird dann als Template in der PCR verwendet. Mittels Primern, die man für sein spezifisches Produkt ausgewählt hat, wird dann das zu untersuchende Genstück amplifiziert und kann analysiert werden. (ist es überhaupt vorhanden, ists mehr, ists weniger, usw.) | | Beiträge 1 bis 4 von 4 angezeigt. |
|
|
