Größe von PCR-Produkten für semiquantitative RT-PCR |
| simone | 2011-04-21 01:22:19 |
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Beitrag #1 • | Hi,
ich versuche die Expression einiger Gene im Wildtyp mit denen der in einer Mutante zu vergleichen (Drosophila). Das ganze möchte ich semiquantitativ machen und versuche die Expression jeweils in Relation zu einem housekeeping Gen zu bewerten. Nun habe ich folgendes Problem, die PCR an meinen cDNAs für das housekeeping Gen funktioniert immer wunderbar, aber für all die anderen Gene, die ich untersuchen möchte, überhaupt nicht, obwohl die Primer eigentlich funktionieren sollten, zumindestens habe ich sie an genomischer DNA getestet und auch an der cDNA diverse Optimierungsversuche unternommen.
Nun frage ich mich, ob es wohl daran liegt, dass ich meine Primer so gewählt habe, dass meine PCR-Produkte zwischen 800bp und 1kb liegen, ist das vielleicht viel zu groß und meine isolierte RNA für die cDNA ist möglicherweise degradiert (mache das ganze mit einem Kit aber sonst nicht in einem speziellen RNase-freien Bereich. Mein PCR-Produkt für das housekeeping Gen ist nur um die 400bp groß. Was für Fragmentgrößen emphehlt ihr oder könnte es an etwas anderem liegen? Ich nehme für die cDNA-Synthese ramdom hexamer Primers und meinen Bereich den ich amplifizieren will,liegt immer in der 3'UTR und im 3'ende der mRNA, sollte ich es vielleicht mal mit PolydT primern versuchen,aber eigentlich sollte es ja nicht daran liegen?? (Habe so grosse PCR Produkte gewählt, weil ich dachte, dass ich dann am Ende die Primer auch gleich für die Sequenzierung meiner Gene nehmen kann ;( , was ich dann auch vor hatte)...
Einen schönen Abend noch.
Simone
| | acribio | 2011-04-21 14:18:54 |
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Beitrag #2 • | >ist das vielleicht viel zu groß
ja!
Gibt jetzt zwei Möglichkeiten:
Nimm vielleicht Primer, die ca. 300bp lange Fragmente erzeugen,
die kannst dann auf einem Gel noch von den Haushaltsgenen unterscheiden.
Ich selbst tendiere so zu PCR-Fragmenten von ~100bp Länge (!!)
Aber jetzt zur Begründung, und damit zu Möglichkeit 2:
Warum sollte es mit Produkten, die länger sind Probleme geben?
Ich schätze, dass das PCR-Programm, dass bei housekeeping Bande mit 400bp nur ganz bedingt geeignet ist, für ein andere Bande mit 800-1000bp. Der Grund wird vermutlich in der zu geringen Extension Zeit liegen (hängt natürlich auch von Polymerase-Typ ab; Taq oder Proof-reading). Deshalb oben die Empfehlung, einmal ein Primer zu nehmen, der eine ähnliche Produktgröße, wie beim housekeeping-Gen hervorbringt.
Mit längeren Produkten hat man oft etwas mehr Probleme, gibt allerhand Gründe.
Zu heikle heikle Tm-Berechnungen => zu hohe Annealing-Temperaturen => zu wenig Produkt
Ich nehme nur 42-45°C selbst bei 50-100bp Primern, warum auch nicht. Da bindet der Primer wenigstens. Schmelzpunktsberechnungen sind Akademischer Nonsense. Bedenke auch: Der Schmelzpunkt ist der Punkt bei dem NUR 50% gebunden sind! 50% eben nicht!
Also weitere Möglichkeit: Programm ändern, denn eigentlich sollte ein 800bp Stück auch kein Problem sein, ist es aber leider oft.
Du nimmst vermutlich die Taq Polymerase? Extension Time sollte dann >40sek liegen (900bp / 25bp/sek =~ 35sek/Strang).
Wenn du jedoch schon über diesen 40sek liegst, dann könnte die Ausbeute einfach zu gering sein. Absenken der Annealing Temperaturen (42°) plus Anhebung der Zykluszahl auf 35-45 könnte abhelfen. Zusätzlich muss natürlich die Spezifität gewahrt werden, deshalb: Annealing-Temp. nie länger als 15sek. Nur länger bei 50µlPCRs
Wie sieht denn Dein Programm aus?
btw FROHE OSTERN | | simone | 2011-04-21 14:46:16 |
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Beitrag #3 • | Hi,
ich habe bereits Tag als auch Phu-Pol genommen.Jeweils 30 Zyklen.
mit Tag
10s 95°
30s Annealing
2min extension/4min extension
mit Phu
10s 98°
30s annealing
1min/1,5min extension
oder meine Gene werden einfach nur so gering expremiert, was allerdings für zumindestens 2 nicht der Fall sein sollte...
Ja, frohe Ostern! | | acribio | 2011-04-22 09:57:51 |
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Beitrag #4 • | Phu ? Du meinst vermutlich pfu-Polymerase
Du verwendest bei der Taq - Polymerase eher noch längere Extension-times als bei der pfu.
Die Taq ist ungefähr 20-25bp/sek schnell, die pfu nur ~6bp/sek!!
Das beachtet fast niemand, obwohl es essenziell ist.
vielleicht zur Einstimmung einmal hier lesen
http://www.acribio.com/forum/f5-t120-Problem-bei-PCR.html
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