komplementäre Primer

simone

2011-04-13 02:19:20

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Beitrag #1 •

Hallo,
ich habe ein Plasmid in welches die cDNA meines Proteins so kloniert ist, dass mein Protein mit einem HA tag am C Terminus exprimiert wird. Nun will ich diesen tag wieder loswerden, damit ich das Protein ohne Einfluß des tags untersuchen kann (HA tag könnte möglicherweise einen Effekt auf die Wirkung haben?). Macht es Sinn, wenn ich einen Primer designe, der komplementär zum C Terminus meines Proteins ist und dann am 3'Ende komplementär zu dem Ende der cDNA was ursprünglich nach dem HA tag kommt, sprich stop codon und generierter Schnittstelle für ein Restriktionsenzym? Also, mein Template ist Protein-Sequenz, HA-Sequenz, Stopp Codon, Schnittstellen-Sequenz und mein Primer dann komplementär zur Protein-Sequenz, Stopp Codon, Schnittstellen-Sequenz aber nicht zur HA-Sequenz.
Kann das funktionieren? oder wird es grosse probleme geben, da der Primer ja entweder nur an die Protein-Sequenz oder nur an die End-Sequenz binden kann (hier dann keine Amplifikation???)
Entschuldigung, wenn ich mich etwas verwirrend ausgedrückt habe!

acribio

2011-04-15 11:08:12

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Beitrag #2 •

Hallo Simone,

ich bin der Meinung, soetwas kann durchaus funktionieren. Ich würde allerdings eine proof-reading polymerase nehmen und dann so ca. 6-11min für jeden Zyklus extension time.

da der Primer ja entweder nur an die Protein-Sequenz oder nur an die End-Sequenz binden kann

Die Stücke die binden, sollten auf jeden Fall mehr als 22-25 bp Lönge aufweisen. Nimm 30 bp vor und nach dem HA-tag.

hier dann keine Amplifikation???

Du spielst vermutlich darauf an, dass dann möglicherweise so etwas wie eine nicht komplementäre Schleife entsteht, die die Amplifikation behindert...

Das Ganze läuft so ab:
Der Primer bindet und dabei gibt es drei Möglichkeiten:
1.)Er bindet vor UND nach dem HA-Tag, wie gewünscht und die codons des Plasmids mit dem HA-Tag nicht.
2.) und 3.) Sollte die obige Struktur zu problematisch sein, so bindet jeweils nur ein Strangteil, also ENTWEDER der Teil vor dem HA-Tag ODER der nach dem HA-Tag.

Aber welcher Teil kann jetzt nur von der Polymerase prolongiert werden? Es ist der 5' Teil, der gebunden sein muss. Und das bedeutet, es können nur die Stränge 1.) und der Teil bei dem der Primer "im Inneren" Deines codierten Proteins, also VOR dem HA-Tag gebunden hat prolongiert werden.

Beim übernächsten Zyklus spielt das keine Rolle mehr, denn dann werden bereits die Stücke amplifiziert, die prolongierte Primer enthalten.

simone

2011-04-15 23:20:49

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Beitrag #3 •

Vielen Dank für die Antwort!

Die Stücke die binden, sollten auf jeden Fall mehr als 22-25 bp Lönge aufweisen. Nimm 30 bp vor und nach dem HA-tag.

Dann wäre es ja am besten wenn ich ganz viele Basen vor dem tag nehme und so wenig wie möglich danach, wenn mein Primer gar nicht nach dem HA tag binden würde, wäre es ja sogar besser und keine Schleifen würden gebildet werden oder die Sequenz nach dem tag würde meinen Primer "wegtitrieren"?

acribio

2011-04-18 13:46:19

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Beitrag #4 •

wegtitrieren

so schlimm ists sicher nicht, denn die Amplifikation geht ja erst richtig los, nachdem das Original-Template abgelesen wurde, also wenn die Stücke mit Primer-Enden abgelesen werden.

Ich hatte gedacht, dass hinter dem HA-Tag auch noch ein bisschen Sequenz liegt, die amplifiziert werden soll. Wenn das aber nicht der Fall ist, dann ist Deine Aussage richtig, dass Du hinter dem HA-Tag nicht genausoviel bp Homologie brauchst. Die beschriebene Variante ermöglicht auch ein "Herausschneiden" inmitten der Sequenz.

Bleibt bloß noch die Frage, ob der Vektor gleich mitamplifiert werden soll, oder nur das Insert.
Viel Erfolg ;)

simone

2011-04-21 00:29:12

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Beitrag #5 •

Viel Erfolg ;)

Ja, danke, hat super geklappt :)

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