digest nach PCR? |
| Labie | 2010-12-14 12:35:02 |
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Beitrag #1 • | Hallo,
ich habe nun meine PCR durchgeführt, mit dem Primer set für mein gewünschtes Gen, um zu prüfen, ob es denn überhaupt exprimiert wird. das template war eine cDNA.
als Kontrolle habe ich primer für ß-Actin genommen.
meine Frage: muss ich einen digest machen, oder recht es wenn ich die PCR -Produkte einfach unverdaut aufs Agarosegel laufen lasse???
Habe es gestern mit einem 2,5 % gel durchgeführt ( erwartete Größe der Fragmente. 240 - 380 bp)
125 V
Ergebnis: nach den ersten 15 min: Marker nicht ganz aufgetrennt, dicke Banden nur bei ß-Actin gesehen.
Habe es dann noch weitere 15 min bei 150 V laufen lassen>> dannach war nichts zu sehen !!!!!
Was kann da passiert sein??
Ausgelaufen wohl kaum oder???
Mein Gel war allerdings alt ( ca 3 Wochen bei 4°C gelagert)
Wäre euch für Tipps dankbar :-))) | | acribio | 2010-12-15 09:51:03 |
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Beitrag #2 • | Hallo Labie,
ein Verdau birgt natürlich zusätzliche Probleme. Ausbeuteverluste, etc.
Wenn Du nur gucken willst, ob überhaupt exprimiert wird, dann reicht es die PCR aufs Gel aufzutragen. Das Gel sollte natürlich stimmen. 3 Wochen altes Gel? Was willst du denn damit? Würde ich nicht nehmen. Kann schon sein, dass da Keime hochwachsen, selbst im Kühlschrank bei 4°, die dann DNAsen und besonders RNasen zur Verteidigung absondern.
>Nichts mehr zu sehen?
Also jetzt eröffnen sich zu viele Möglichkeiten, auf die man nachfragen müsste...
z.B. Ist der Marker auch weg? Nebenbei: Marker sollte natürlich getrennt sein.
Ist ß-Aktin auch nicht mehr zu sehen?
(Nebenbei, ß-Aktin ist wohl nicht als interne Kontrolle in der eigentlichen PCR?)
2.5%iges Gel ist in der Tat schon reichlich dünn. Kleinere Banden sollten da schnell mal weg sein (aber Deine Fragmente sind reichlich groß)
Möglicherweise hast Du zuerst nur die Primer gesehen?!? Die laufen natürlich unterhalb und sind in einem großen Überschuss vorhanden.
Bei längerer Laufzeit verarmen insbesondere die Primer sehr stark an Ethidiumbromid / Sybr green, sodass oft der Eindruck des Verschwindens entsteht.
Hast Du es mit Nachfärben und erneutes Entfärben des Gels versucht?!
| | Labie | 2010-12-15 10:00:12 |
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Beitrag #3 • | Hi Acribio,
ich habe gestern einfach ein neuse gel gegossen und siehe da, alles war super :-)...also lags wahrscheinlich am gel. ich habe uch einen neuen loadingbuffer genommen.
was meinst du mit "interne " ß-actin Kontrolle?
also die waren dick zu sehen, bei meinem eig primern die ich testen wollte,w aren schwache banden zu sehen, also heisst es, das gen wird doch exprimiert, nur nicht so stark oder wie kann ich das deuten? jetzt würde eig eine qRT-PCR anstehen oder? um genau zu schauen, wie viel exprimiert wird!
PS: danke für die rückmeldung | | acribio | 2010-12-15 10:21:51 |
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Beitrag #4 • | >und siehe da, alles war super :-)
siehste :D
Interne Kontrolle: Wenn Du die Primer von ß-Aktin zusammen in einer PCR mit den Primern Deines Gens verwendest. Die ß-Aktinbande ist dann in der gleichen Spur, wie die Deines Zielgens (wenns klappt ;)).
>das gen wird doch exprimiert, nur nicht so stark oder wie kann ich das deuten?
Richtig. ß-Aktin wird eben sehr stark exprimiert. Glaub beinahe 1% aller mRNAs sind ß-Aktin...
>jetzt würde eig eine qRT-PCR anstehen oder?
ja denke schon! Viel Glück!! Das wird schon ;) | | Beiträge 1 bis 4 von 4 angezeigt. |
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