ß-actin als Kontrolle |
| Labie | 2010-12-09 10:47:14 |
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Beitrag #1 • | Hallo,
bin ein relativer newbie im Labor :-).
Habe RNA aus Tumorpräparaten extrahiert und cDNA synthetisiert. Nun sollte ich eine PCR machen, um zu schauen, ob ein bestimmtes Gen exprimiert wird oder in diesen Tumorzellen die Expression niedriger ist.
Ich sollte eine ß-actin Kontrolle machen, um zu schauen, ob die cDNA Synthese üerhaupt funktioniert hat. Nun meine FRage:
Kann ich die Primer des ß-Actin in die selbe Probe reinschmeissen oder muss ich aus meinem cDNA template jeweils 2 Ansätze machen: einmal mein Genprimer und einmal den ß-Actin Primer?!?!
Wie kann ich dann später anhand der Bande im Gel messen, wie groß die Expression meines Gens ist???
Ist das nicht etwas zu "schwammig"???
Würde mich über Antworten freuen!!! Oder auch schöne Literaturhinweise, habe schon den Mülhardt:-)
Danke! | | Labie | 2010-12-09 10:47:25 |
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Beitrag #2 • | Hallo,
bin ein relativer newbie im Labor :-).
Habe RNA aus Tumorpräparaten extrahiert und cDNA synthetisiert. Nun sollte ich eine PCR machen, um zu schauen, ob ein bestimmtes Gen exprimiert wird oder in diesen Tumorzellen die Expression niedriger ist.
Ich sollte eine ß-actin Kontrolle machen, um zu schauen, ob die cDNA Synthese üerhaupt funktioniert hat. Nun meine FRage:
Kann ich die Primer des ß-Actin in die selbe Probe reinschmeissen oder muss ich aus meinem cDNA template jeweils 2 Ansätze machen: einmal mein Genprimer und einmal den ß-Actin Primer?!?!
Wie kann ich dann später anhand der Bande im Gel messen, wie groß die Expression meines Gens ist???
Ist das nicht etwas zu "schwammig"???
Würde mich über Antworten freuen!!! Oder auch schöne Literaturhinweise, habe schon den Mülhardt:-)
Danke! | | acribio | 2010-12-10 15:16:47 |
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Beitrag #3 • | >Primer des ß-Actin in die selbe Probe reinschmeissen
das wäre dann einen interne Kontrolle. Das ist aber glaub nicht so sinnvoll (ohne Garantie!!). Die zwei PCR-Produkte könnten sich beeinflussen. Das häufigere Produkt drängt das seltenere in der Amplifikation durch dNTP und Polymerase-Verbrauch zurück.
Wirklich vergleichbar sind wohl nur die Banden mit deinem Tumorgen-Primer.
Ebenso sind die ß-Aktin Kontrollen vergleichbar. Ich würde an vier PCRs denken.
(Würde vielleicht auch an GapdH oder Cyclophilin als Housekeeping Gen denken, denn diese werden nicht sooo stark exprimiert wie ß-Aktin. Mit solchen schwächer exprimierten Genen sind möglicherweise interne Kontrollen möglich!?)
| | Labie | 2010-12-13 15:47:11 |
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Beitrag #4 • | Ok :-),
Danke vielmals, ich habe 4 unterschiedliche Tubes genommen und die andere interne Kontrolle als ß-Actin, da werde ich mal mit meinem Supervisor sprechen, habe auch etwas recherchiert und gelesen, dass ß-actin nicht immer zuverlässig ist.
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