ich habe eine Frage zur Real Time PCR |
| christina2010 | 2010-09-01 13:39:49 |
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Beitrag #1 • | Hallo miteinander!
ich habe eine Frage zur Real Time PCR.
Als template verwende ich cDNA, die ich mittels reverser Transcriopion aus RNA gewonnen habe. Dabei führe ich selbstverständlich auch minusRT-Kontrollen mit. Leider kommt es manchmal vor, dass diese Kontrollen positiv sind. Ein DNase-Dau vor der reversen Transkription wäre zwar effektiv, hat aber den Nachteil, dass ich dabei Teile meiner ohnehin gering vorhandenen RNA verliere.
Gibt es eine Möglichkeit mithilfe des ct-Wertes einer minusRT-Kontrolle, den ct-Wert der eigentlichen Probe mathematisch zu berichtigen?
Ich nenne ein Fallbeispiel:
ct-Wert der Probe: 30
ct-Wert der zugehörigen minusRT-Kontrolle: 33
Das heißt also die Probe enthält (bei einer PCR-Effizienz von 2) 12,5% genomische DNA, die fälschlicherweise mitamplifiziert und mitgemessen wurde [ 2^(30-33)=0,125 ] .
Wie müsste nun der Wert von 30 aussehen, wenn die genomische DNA nicht vorhanden wäre und wie berechne ich diesen Wert?
| | acribio | 2010-09-01 18:10:13 |
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Beitrag #2 • | hallo,
schon mal zwei Links zur Erklärung des ct-Wertes
http://de.wikipedia.org/wiki/Ct-Wert
http://www.laborjournal.de/rubric/methoden/methoden/v21.lasso
| | acribio | 2010-09-16 10:44:08 |
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Beitrag #3 • | hallo nochmal,
also ich möchte noch mal ganz dringend von der von Dir vorgeschlagenen Vorgehensweise abraten!
Meiner Meinung nach ist die PCR bei weitem nicht so sensitiv, wie viele immer glauben. Wenn du in der Negativkontrolle etwas siehst, dann musst du immer an Kontaminationen denken! Primer, Taq, Nukleotide, Wasser, Mix und und und. Alles muss absolut clean sein, am besten alles aliquotieren und vielleicht mal so eine PCR-Haube in Erwägung ziehen. Die müssen allerdings auch regelmäßig gereinigt werden. Die Kontamination durch DNA schiebt man gerne vor, da man dadurch schuldfrei ist und es ist leider in den seltensten Fällen der Grund.
Und selbst wenn wirklich DNA in der Negativkontrolle eine Bande erzeugt, dann ist doch die Vergleichbarkeit von Probe zu Probe nicht gegeben und es ist nicht davon auszugehen, dass eine "Grundbande" dieser "Stärke" in den anderen Proben ebenfalls vorhanden ist. Es ist lediglich dein Fehler größer geworden.
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