inverse PCR |
| simone | 2009-11-11 17:59:39 |
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Beitrag #1 • | Hallo, ich habe eine Frage zur inversen PCR. Mit der inversen PCR soll ich schauen in welchen Genombereich mein Transposon (P-Element im Drosophila-Genom) inseriert ist. Zunächst schneide ich ja mit einem Restriktionsenzym mein Element + angrenzende Bereiche aus der genomischen DNA heraus und ligiere die DNA als Plasmid. Für die PCR nehme ich dann Primer, die mit der Transposon-DNA hybridisieren und auseinanderlaufen. So hier nun meine Frage: muß das Plasmid vor der PCR erneut geschnitten werden und zwar nun mit einem Restriktionsenzym, dass innerhalb des Transposons schneidet, so dass für die PCR ein lineares Template vorliegt und die Primer aufeinander zulaufen?Oder kann die PCR direkt am zirkulären Plasmid mit auseinanderlaufenden Primern durchgeführt werden?
Vielen Dank, Simone | | acribio | 2009-11-12 15:32:50 |
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Beitrag #2 • | Hallo,
ich habe hier zuerstmal einen Link, wo man sich über die inverse PCR schlau machen kann:
http://de.wikipedia.org/wiki/Inverse_Polymerase-Kettenreaktion
| | acribio | 2009-11-12 15:36:56 |
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Beitrag #3 • | >Plasmid vor der PCR erneut geschnitten werden
Ich denke schon!
>und zwar nun mit einem Restriktionsenzym, dass innerhalb des Transposons schneidet
ja genau
>und die Primer aufeinander zulaufen?
exakt!
| | acribio | 2009-11-12 15:46:17 |
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Beitrag #4 • | Du kannst es auch ohne vorheriges zweites Schneiden zu versuchen (Ohne Garantie). Die PCR ist dann zwar "open end" und das Template ist möglicherweise ein Plasmid, welches ordentlich verdrillt ist. Aber die ersten Stücke der PCR, die als weitere Templates dienen, sind linear und nach der zweiten Ablesung hat das Zielstück die richtigen Länge.
Dieses wird dann exponenziell amplifiziert (ca. alle drei Zyklen findet eine Verdopplung statt) und mit ein zwei Zyklen mehr sieht man keinen Unterschied.
| | simone | 2009-11-13 18:48:57 |
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Beitrag #5 • | Ok, dann versuche ich es erstmal ohne ein zweites Restriktionsenzym...Vielen Dank für die Antworten! | | acribio | 2009-12-15 15:13:44 |
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Beitrag #6 • | hi
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