Template cDNA or DNA of human TCR: why complications? |
| antonioIT | 2009-09-11 13:31:15 |
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Beitrag #1 • | Folgendes Problem:
Mein Ziel ist es von T-Lymphocyten, das T-Cell-Rezeptor (TCR)-Gen zu amplifizieren. Das TCR-Gen ist ein spezieller Fall insofern, dass während der Differenzierung dieser T Zellen, auf der DNA-Ebene hier ein rearrangement stattfindet, d.h VDJ-C Gensegmente (z.B. im Falle der beta-chain des TCRs) "finden zueinander", indem sog. RAG-Enzyme Introns rausschneiden (Theorie grob besprochen).
D.h. aus genomischer DNA entsteht eine DNA, die direkt als mRNA transkribiert wird, ohne dass dann weitere Prozessierungsschritte(d.h.Spleißen) notwendig wären (abgeshen jetzt von Capping und polyAtailing).
Bis jetzt habe ich immer von der mRNA (!) ausgehend diesen TCR (beta-chain) erfolgreich amplifiziert (d.h. ich habe aus den Zellen die total RNA isoliert und daraus cDNA gemacht als template für die PCR).
Der fwp liegt dabei in einem sog.V-Gen und der rw liegt im sog. C-Gen (bzw.region).
Nun besteht aber die Notwendigkeit, aus der DNA selber (!) dieses rearrangierte Gen (beta-chain vom TCR) zu amplifizieren.
Ich habe dafür die selben Primerpaare verwendet wie für die cDNA.
Das Problem: ich kriege viele unspezifische(!) Banden und z.T. gar nicht(!) das erwartete Amplikon (welches misst ~190-270bp, je nach V-Gen, denn ich verwende 22 versch.fwp für die (22)versch. humanen V-Genen; der rw Primer bleibt immer der selbe).
Ich habe an der Annealing temperatur ein bißchen herumgespielt (55°C, 58°C, 60°-normalerweise mache ich 60°C w cDNA), habe die Zykluszahl erhöhrt (von 34 auf 50), habe versch. Mengen an DNA (50-500ng DNA) eingesetzt, doch alle diese Maßnahmen haben auf diese unspez. Banden keinen Einfluss.
Wohl eine Rolle spielt die Annealing einen Einfluss, wo ich bei 60°C zumindest bei einigen fwp (sprich TCR-Familien) überhaupt das erwartete Amplikon erhalte.
Meine Frage: Wo könnte das Problem (bzw. die Probleme) liegen?
| | acribio | 2009-09-11 21:59:47 |
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Beitrag #2 • | Hallo Antonio,
>doch alle diese Maßnahmen haben auf diese unspez. Banden keinen Einfluss.
ja - vermutlich ist der entscheidende Punkt noch nicht getroffen.
>wo ich bei 60°C zumindest...überhaupt das erwartete Amplikon erhalte.
Eine Erhöhung der annealing Temperatur scheint ja einen positiven Einfluss zu haben, es entstehen jedoch Nebenprodukte.
Meine Meinung: Auch wenn es so aussieht, dass eine Erhöhung der Annealing-Temperatur etwas bringt, es ist AUCH nicht der entscheidende Punkt.
Ich würde einmal folgendes PCR Programm probieren:
10-20µl Ansätze in dünnwandigen 100µl-Tubes in einem kleinen
PCR - Gerät das 25 Gefäße aufnehmen kann.
- Taq-Polymerase (die nimmst Du doch wohl?)
- 7-10sek annealing temperatur 45°C und dann
- 15-20sek extention time 72°C
- 10 sek 95°C Denaturieren
- die drei Schritte zyklisch zu je 35,45,55 wiederholen
Die Nebenprodukte entstehen oft durch ZU LANGE Annealing Zeiten
von 30-60sek. Da ist selbst die pfu Polymerase bei 270bp fragmenten schon durch. die Taq braucht nur 15sek und die Nebenprodukte entstehen meist bei der Annealing-Time.
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