qRT-PCR GAPDH kommt nicht |
| kollagen | 2009-08-12 09:40:36 |
Profil
Beitrag #1 • | Hallo,
ich fahre eine qRT-PCR mit sybr green master mix im corbett rotor gene 3000, bekomme aber ausgerechnet bei meinem housekeeping Gen GAPDH kein Signal, andere Gene z.B. Kollagen ist ok. der GAPDH Primer funktioniert, cDNA ist auch ok, habs im "normalen" PCR Cycler ausprobiert und schöne Banden bekommen. den GAPDH primer hatte ich auch schon primeroptimiert mit dem rotor gene, da hats auch noch funktioniert.
hat jemand irgendeine Idee wo der Fehler liegen könnte?
lieben DAnk schon jetzt. | | acribio | 2009-08-12 19:47:08 |
Profil
Beitrag #2 • | Hallo,
handelt es sich um Zellen, die Kollagen exprimieren?
da könnte schon die Kollagen-cDNA in größeren Menge, als die GAPDH-cDNA sein.
Hast du auch keine Bande, wenn du KEINE Kollagen-Primer, sondern NUR GAPDH-Primer nimmst? (Die "schwächere" Bande wird in einer
multiplex-PCR noch schwächer)
wie lang ist das Gapdh-Fragment?
Es könnte auch sein, dass die Extension time nicht ausreicht, für
das (zu lange) GAPDH-Fragment zu amplifizieren. =>Extension time erhöhen.
Es hört sich so an, als wenn die PCR-Bedingungen von der normalen PCR nicht übertragbar sind. Die Programme sind vermutlich zu unterschiedlich.
Vielleicht einfach mal die Annealing-Temperatur deutlich erniedrigen.
Oft sind die Primer-Schmelztemperatur zu hoch und/oder die Annealing-Temperatur zu hoch gewählt.
Man sollte die Annealing-Temperatur nicht auf die Schmelztemperatur "abstimmen". Besser ist es die Annealing-Temperatur <50° C zu wählen z.B. 45°C oder notfalls 42°C
und die Primer stets mehr als 25bp (ohne die Schmelztemperatur zu beachten).
Sollte z. B. die Schmelztemperatur dadurch (bedingt durch den GC-Gehalt) sehr hoch werden, so heisst das nicht, dass der Primer jetzt gleich "überall" bindet. Er bindet lediglich an seiner "Sollstelle" sehr gut. Er bindet mit 25bp auch dann an seiner Sollstelle noch gut, wenn der GC-Gehalt nicht so hoch ist. Eine niedrige Annealing-Temperatur erhöht jetzt die Ausbeute deutlich, nur wenn Nebenprodukte entstehen, dann muss man vorsichtig sein. Dann wirds aber auch Zeit, andere Primer-Sequenzen zu wählen.
Viel Erfolg ;) | | Beiträge 1 bis 2 von 2 angezeigt. |
