PCR Problem 3,8kb PCR klappt nicht - Frage nach Hilfe |
| Carin | 2009-03-09 18:03:15 |
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Beitrag #1 • | Hallo,
ich probiere schon seit geraumer Zeit ein Fragment zu amplifizieren, das etwa 3,8kb groß ist. Ich habe schon alles mögliche ausprobiert. manchmal klappts, meistens aber nicht. Wenn es klappt, ist die Bande meist sehr dünn (oftmals tauchen dann auch noch andere sehr dünne Banden auf).
Ich habe schon mehrere Primer ausprobiert, die Annealing-Temperaturen verändert, die Elongationszeit auf 4min erhöht, DMSO zugegeben, obwohl es nicht nicht gerade um ein GC-reiches Fragment handelt, Primer-und dNTP-Konzentrtionen erhöht, verschiedene Taqs ausprobiert (a-Taq, High-Fidelity, Long-PCR Enzyme Mix).
Ich mache gerade meine Diplomarbeit und habe daher nur begrenzt Zeit.
Ich würde mich sehr über weitere Tipps und Ideen freuen.
Vielen Dank.
Gruß | | acribio | 2009-03-10 18:16:42 |
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Beitrag #2 • | Hallo Carin,
Ich versuche ich jetzt mal zu erraten:
1.) Vermutlich wird es sich nicht um die Amplifikation von einem Plasmid handeln, sondern du versuchst von z. B. cDNA zu amplifizieren.(?)
2.) Eine Klonierung dieses Fragments ist nicht das Ziel der PCR
Wenn dem so ist (2.) , dann wäre die Taq-Polymerase ausreichend und deine vorgewählten 4min Elongationszeit sind genau richtig.
4min würden jetzt nicht reichen, wenn du eine proof-reading Polymerase nehmen würdest, dann solltest du 11-12min! anpeilen (6bp/sek).
Wenn 1.) zutrifft: Hm ein Fragment von 3,8kb zu amplifizieren ist natürlich sehr schwer von cDNA! (Oft verzweifelt man ja schon,
sowas von einer Plasmidpräp zu amplifizieren :D)
high fidelity und long-PCR sind mit geringerer Fehlerrate als normalo Taq, aber schneller als proof-reading pfu ? (sollst vermutlich doch
klonieren?!?! da muss erst die PCR mit Taq mal funktionieren )
Also: Versuchen erstmal mit der Taq ein richtig schönes Fragment zu bekommen.
Was müsstest anders machen? Gute Frage. Ich probiers mal:
Nimm 45Zyklen (und mehr)
Nimm 42° Annealingemperatur ca. 15-20sek (je nach µl der PCR, also 10-15µl = 15sek annealing Temperatur, 50µl PCR -> 20-25sek )
Nimm AUSREICHEND cDNA also z. B. 1-3µl eines 20µl cDNA-Ansatzes
Trage Am Ende nicht zu wenig aufs Gel auf, also 10µl von einem 10µl ansatz,
20µl von einem 50µl Ansatz.
15sek 95°C Denaturierung (nicht zu lange auf der Polymerase herumbraten)
Und jetzt noch der Schlüssel zum Erfolg:
Gib die Polymerase (ausreichend, z. B. 1-3ml 5U/µl) ERST hinzu, wenn
die PCR ca. 1min bei 95°C aufgeheizt war! ( Hot Start)
So können keine Elongationen bereits bei Raumtemperatur entstehen. (und machs nie wieder anders)
Wie gehst du vor, wenn du jetzt schöne Bande siehst und doch klonieren möchtest? Denn das Taq-Produkt enthält zuviele Fehler!
Nimm die Pfu-Polymerase und rechne mit 5-6bp pro Zyklus! bei 3800 / 6 = ~ 633 sek = /60 = 10.5 min !!
mache die PCR ansonsten genauso, also auch 45 zyklen und mehr und
Wird schon! (*aufdieSchulterklopf*) | | Carin | 2009-03-11 21:11:41 |
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Beitrag #3 • | Hallo,
danke schön, für diese zahlreichen Tipps!
Entschuldige, dass ich nicht ausführlicher geschrieben habe, um was für ein Fragment es sich handelt und ob ich es klonieren möchte oder nicht. Aber ja, hast richtig geraten.
Ich habe heute noch einmal eine PCR angesetzt mit der normalen Taq und hab alles beachtet, was du mir vorgeschlagen hast. Leider hat es nicht funktioniert :-(
Diesmal war auf dem Bild ein leichter Schmier zusehen und in den Taschen ist das Produkt wahrscheinlich hängen geblieben. Hat jemand eine Idee, wie man verhindert, dass das Produkt nicht in den Taschen hängen bleibt? Dieses Problem hatte ich auch schon ein paar mal.
Danke schon mal im Voraus.
Liebe Grüße | | acribio | 2009-03-13 13:02:36 |
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Beitrag #4 • | Ich würde empfehlen, unbedingt mit einem erheblich kleineren PCR-Produkt anzufangen
also z. B. 150bp
500bp
und dann vielleicht noch 1400bp
Primer würde ich mit 25bp Länge wählen.
die cDNA muss auch super gut sein! Also Kontrollgene
solltest du entsprechenden Primern mitlaufen lassen.
Wenn du auch die cDNA herstellst, dann ist in aller Regel
DA das Problem, bzw. noch weiter vorne - bei der Herstellung der RNA!!
Die RNA muss absolut topp sein und ist am schwierigsten herzustellen. cDNA-Synthese und PCR sind meiner Meinung nach die kleineren Hürden.
Produkte in der Tasche? puh (*kopfkratz*)
Ich hatte oft Proteine, die so eine "Bande" in der Tasche hinterliess.
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