geisterhafte Bande |
| Tihana | 2009-01-14 19:32:01 |
Profil
Beitrag #1 • | Hallo!
Hatt irgend jemand eine Idee, was passiert sein kann, wenn ich eine klare Bande (ca. 650bp, genauso wie die Erwartete) in der Negativkontrolle (keine DNA enthalten) und in allen anderen Ansätzen habe (auch wo sie nicht enthalten sein dürfte). Wenn ich allerdings noch einen dritten Primer zugebe, der mit dem Reverseprimer ein Produkt geben würde, stimmt das komplette Banden Muster mit den Erwartungen wieder überein. An irgendwelchen Kontaminationen kann es eigentlich auch nicht liegen, da ich alles ausprobiert habe (neue Primer bestellt, alles geputzt, in anderem Labor mit anderem Material pipettiert, jemand anderen mit anderem Material pipetieren lassen...) und das gleiche Problem mit der genomischen DNA dieser T-DNA-Insertionslinie einer Erbsenpflanze schon einmal hatte.
Ich weiß echt nicht mehr weiter, wäre schön, wenn jemand eine Idee hätte!! | | acribio | 2009-01-15 12:52:47 |
Profil
Beitrag #2 • | Hallo Tihana,
willkommen im Forum
| An irgendwelchen Kontaminationen kann es eigentlich auch nicht liegen... |
|
Falsch! Es MUSS an Kontaminationen liegen. :D - Tröste dich, es ist noch keine Bande vom Himmel gefallen.
Ob die falsche Bande durch Zugabe von weiteren Stoffen verschwindet ist egal, daran würde ich keine Gedanken mehr verschwenden, zuerst muss die Bande in der Negativkontrolle verschwinden.
Um solche Kontaminationen zu vermeiden ist vor allem wichtig, bereits die Primer und die Nukleotide mit 1a sterilem und autoklaviertem Wasser und mit sauberen (möglichst autoklavierten) Pipetten anzusetzen!
Das Gleiche gilt dann für die Primerverdünnungen und die Nukleotide nicht zu vergessen.
Die Primerverdünnungen und auch die Nukleotidverdünnungen sollte man darüberhinaus aliquotieren, d. h. in kleineren Portionen einfrieren, damit man in so einem Fall wie bei dir, nur das aktuelle Aliquot wegwerfen muss.
Die benutzen Pipetten sind natürlich auch von großer Bedeutung, Pipetten sollten hin und wieder autoklaviert werden (Vorsicht, das geht nicht mit jeder Pipette)!!
Verwende für die PCR die besten Pipetten, und für das Auftragen aufs Gel einen zweiten Pipettensatz, der nicht ganz so hochwertig sein muss.
Hast du z. B. einmal eine fertige PCR, die die Bande enthielt, mit der Pipette aufs Gel aufgetragen, dann kann schon mal
das Produkt in die Pipette gelangen und dir so stets als unerwünschtes Template dienen.
Der Ort, wo pipettiert wird ist auch nicht ganz egal. eine saubere Bench ohne Zugluft tut es meist schon, aber es gibt spezielle PCR-Kabinen (die kosten natürlich :-/ ... der Luxus war mir nie vergönnt). Solche PCR-Kabinen können jedoch auch kontaminiert sein. Manche werden mit UV-Licht "dekontaminiert", soweit ich weiss.
Manchmal kann ein ganzes Labor versaut sein, aber du hast ja schon ein anderes Labor probiert...
Handschuhe sind beim Ansetzen der PCR sicher nicht verkehrt.
Zu guter Letzt muss natürlich auch das PCR-Programm top sein! Ein gutes PCR-Programm hat eben nicht nur eine große Ausbeute, sondern zeichnet sich dadurch aus, dass es wirklich NUR dein Template amplifiziert, und wenn keins drin ist - dann sollte auch keine Bande kommen...
Anregungen zum PCR-Programm:
Dein Produkt hat 650bp, d. h. ca 40sek. Extension time bei 72° reichen, wenn du die Taq benutzt! Nicht mehr!
Dazu 15sek Annealing-time (ebenfalls:nicht mehr!) bei 45-50°C und dann 30, 35 oder 40 Zyklen probieren. Und nimm nur 10 oder 20µl PCRs, die du komplett aufs Gel aufträgst.
Ich hoffe es waren ein paar Anregungen dabei ;)
| | Tihana | 2009-01-15 19:59:40 |
Profil
Beitrag #3 • | Vielen Dank für den Beistand und die Gedanken! Du hast auf jeden Fall recht, wenn du sagst, dass ich mir nicht den Kopf zerbrechen soll, was passiert, wenn ich einen dritten Primer zugebe, solange ich eine Bande in der Negativkontrolle habe. Ich weiß ja auch, dass das nur an einer Kontamination liegen kann, da ich aber echt alles versucht habe, hab ich irgendwie an allem zu zweifeln angefangen... und von daher hat mir deiner Meinung schon sehr weiter geholfen! Ich werde mir wohl neue Primer erstellen und noch etwas an meinen Bedingungen tüfteln...
Auf jeden Fall danke...;-) | | Beiträge 1 bis 3 von 3 angezeigt. |
