PCR-Primerkonzentration |
| acribio | 2008-11-28 20:08:55 |
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Beitrag #1 • | Welche Aspekte sind bei der Auswahl der optimalen Primerkonzentration zu berücksichtigen?
Wenn man die Ausbeute erhöhen möchte, dann muss man logischerweise dafür sorgen, dass bis zu den letzten Zyklen der PCR genügend
Primer vorhanden ist. Ein Primerüberschuss sollte also nicht schaden.
Doch Vorsicht!!
Hilft es z. B. bei einer sensitiven PCR, bei der ich Spuren amplifizieren möchte, einen großen Primerüberschuss einzusetzen?
Im Gegenteil! Zuviel Primer schadet.
Um es abzukürzen:
Bei wenig zu erwartendem Produkt (Spurensuche) sollte man die geringe (!) Primermengen einsetzen, dass grade eine ordentliche Bande entstehen kann.
Erwartet man große Mengen an Produkt, dann sollte man erheblich mehr Primer einsetzen (z. B. wenn man ein Template zur Klonierung amplifiziert).
Warum? | Hohe Primerkonzentrationen verschieben das Gleichgewicht "nach rechts" und erleichtern die Bildung von PCR-Produkten an weniger homologen Bindungsstellen. |
|
siehe hier
Bei einem seltenen Templates führt ein riesiger Überschuss an Primer eher
zu unerwünschten Produkten, oder z. B. zu Primerdimeren, als zu höheren Ausbeuten.
Sobald in der PCR ein Produkt entsteht, eben auch Nebenprodukte wie Primerdimere,
werden Primer, Nukleotide und Polymerase verbraucht und dies reduziert deutlich die Ausbeute an erwünschten Produkten!
Also nie zuviel Primer "reinknallen" sondern nur etwas mehr als nötig. | | Nicki | 2008-12-03 14:35:46 |
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Beitrag #2 • | Wenn ich nur ganz ganz wenig Produkt erwarte, wieviel sollte ich dann in einen 50 µl Ansatz (50 Zyklen)ungefähr mischen? | | acribio | 2008-12-03 20:07:04 |
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Beitrag #3 • | Hallo Nicki,
gut dass du dich noch x meldest, ohne konkrete Zahlen bleibt das oben gesagte natürlich Wischiwaschi :-)
Ein PCR-Protokoll
http://www.fermentas.com/techinfo/pcr/dnaamplprotocol.htm
Dort steht, dass die Primer in einer Konzentration von 0.1 - 1 µM vorliegen sollen (das große M heisst molar, d.h. Mol/Liter)
Meist werden die Primer so ausgeliefert, dass man mit einer gewissen
Wassermenge eine Konzentration von 100picomol / µl einstellt, das entspricht
100 µMol/l Primer-Umrechnung siehe hier
Das ist 1000 bis 100-fach stärker konzentriert, als für die PCR eingesetzt werden soll. Jetzt kommt es natürlich darauf an, wie du deine eigene Primer-Verdünnung ansetzt. Ich empfehle, die Primerverdünnung so zu machen:
20µl Original-Lsg. Primer I +20 µl Original-Lsg. Primer II +360µl steriles Wasser
So sind (gleich beide! :-)) Primer 1:20 verdünnt, bzw. die Primerkonzentrationen sind 5µmolar = 5µMol/l . Am besten gleich mehrere Aliquotierungen herstellen und öfter mal wechseln, um Kontaminationsrisiken zu minimieren...
An dem Beispiel einer 50µl PCR:
Wenn du jetzt von der Primerlösung 5µl nimmst, dann wird die Lsg. noch mal 1:20 verdünnt und hat dann 0.5µMol/l Endkonzentration, das ist genau in der Mitte von der angegebenen Konzentration :-) und
passt fast immer.
Wenn du wenig Primer einsetzen möchtest, dann nimmst du 1µl auf eine 50µl PCR, dann haben die Primer je 0.1µMol/l ...
und wenn du viel Primer einsetzen möchtest, dann nimmst du
10µl auf 50µl, dann haben die Primer genau 1µMol/l
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