Die Annealing Temperatur |
| acribio | 2008-11-28 13:49:46 |
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Beitrag #1 • | Die Annealing Temperatur
Welche Aspekte sind bei der Auswahl der optimalen Annealingtemperatur zu berücksichtigen?
Da gibt es zum Einen den Schmelzpunkt (Tm) des Primers, den kann man oft schon mitgestalten.
Meine Empfehlung hier wäre: Möglichst an die 60°C heranzukommen, d.h. nimm besser 22-23 Basenpaare,
das schadet nie.
Wenn man jetzt einen gegebenen Schmelzpunkt Tm hat, wie sollte man die Annealing-Temperatur danach
ausrichten?
Viele sagen sich, dass es nicht verkehrt sein kann die Annealing -Temperatur genau so hoch wie Tm zu wählen.
So möchte man Bindungen des Primers an weniger homologe Sequenzen vermeiden. Doch ist das richtig?
ganz klar: NEIN
Die Schmelztemperatur bei DNA ist als die Temperatur definiert, bei der etwa 50% der DNA gebunden sind und 50% ungebunden!
Das bedeutet, dass auch unterhalb der Schmelztemperatur die Bindung des Primers noch deutlich zunimmt.
Zudem hat man oft in einer PCR Salze und Zusätze (z. B. DMSO), die den Schmelzpunkt nach unten verschieben.
Beides zusammen bedeutet, dass man die Annealingtemperatur ruhig deutlich unterhalb von Tm z. B. 10°C oder sogar mehr ansetzen kann.
Eine zu hohe Annealing-Temperatur vermindert stark die Ausbeute des gewünschten PCR-Produkts.
Aber wie ists jetzt mit unerwünschten Nebenprodukten? Die müssten doch bei erniedrigter Annealing-Temperatur auch zunehmen?
Jein!
Wenn man durch die niedrigere Temperatur ein Zunahme an gewünschtem PCR-Produkt erreichen kann,
dann VERMINDERN sich unerwünschte Nebenprodukte sogar. Sobald in der PCR ein vernünftiges Produkt entsteht,
werden Primer, Nukleotide und Polymerase verbraucht und dies reduziert deutlich die Ausbeute an unerwünschten Nebenprodukten!
Mit Nebenprodukten hat man meist nur zu kämpfen, wenn das gewünschte Produkt nicht entsteht.
Nur wenn auch bei niedrigeren Temperaturen mein gewünschtes Produkt nicht entsteht, dann steigt auch die Wahrscheinlichkeit an,das falsche Produkte entstehen. Deshalb:
Die Annealing-Temperatur muss erst erhöht werden, wenn neben dem gewünschten Produkt auch unerwünschte Produkte entstehen.
Man muss sich von der Schmelztemperatur lösen, dann kann man eigentlich für alle Primer, egal ob 20bp 55°Tm oder 100bp mit Tm knapp an die 100°C die Annealing-Temperatur von 45°C einsetzen. | | Nicki | 2008-11-28 14:46:24 |
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Beitrag #2 • | Danke für diese verständliche Erklärung! | | Beiträge 1 bis 2 von 2 angezeigt. |
