generelle Frage zur PCR |
| Nicki | 2008-11-19 12:50:17 |
Profil
Beitrag #1 • | Hi.
wenn ich eine PCR mache, in der genug DNA mit der entsprechenden Sequenz vorhanden ist, ist es ja normal, wenn hauptsächlich diese Sequenz amplifiziert wird. Ist meine bestimmte Sequenz nicht vorhanden, oder in zu geringer Menge, wird dann irgendetwas amplifiziert? | | acribio | 2008-11-19 18:05:05 |
Profil
Beitrag #2 • | tja - schwierige Frage ;)
Optimal wäre es natürlich, wenn fast überhaupt keine falschen Produkte amplifiziert würden. Das ist natürlich Illusion. Mit abnehmender Homologie wird man immer irgendwelche Stellen auf dem Genom finden, wo der/die Primer mehr oder weniger gut binden, ob dann auch der reverse Primer (oder auch der forward Primer!) in einem Abstand von einer PCR-Produktlänge von ~100-1000bp eine Bindungsstelle findet, an der er halbwegs bindet, ist die nächste Frage.
Gut aufpassen muss man natürlich, wenn man oft "sein" Gen untersucht, welches man eventuell auch in Plasmid-Präparationen großtechnisch herstellt, dass man nicht sein ganzes Labor kontaminiert (sprich Pipetten, Lösungen und und und...). Auf diese Weise kann man leicht sein Template überall verschleppen und dann "findet man es überall", auch in den Negativkontrollen.
Chemisch gesehen bindet ein Primer folgendermassen: Er bindet zuerst vollständig an die DNA, und läuft dann entlang des Stranges, bis er eine Sequenz findet, die möglichst homolog ist. Dabei wird dann die höchste Bindungsenergie frei. Da das Entlanglaufen des Primers am DNA-Strang ein zweidimensionaler Prozess ist, findet er seine Zielstelle erheblich schneller, als wenn er an jeder Position, an der er nicht optimal passt, sich wieder vollständig von der DNA lösen würde.
An seiner Zielstelle bindet er lediglich mit der größten Wahrscheinlichkeit. Entspechend bindet er natürlich auch an allen Stellen mit abnehmender Wahrscheinlichkeit, bei denen die Homologie geringer ist. | | Nicki | 2008-11-21 13:17:20 |
Profil
Beitrag #3 • | Danke für die Antwort, Acribio. | | acribio | 2008-11-21 21:38:25 |
Profil
Beitrag #4 • | Hohe Primerkonzentrationen verschieben das Gleichgewicht "nach rechts" und erleichtern die Bildung von PCR-Produkten an weniger homologen Bindungsstellen.
Und noch was:
Ein 1x falsch geprimter und verlängerter Strang, wird natürlich im nächsten Zyklus "richtig" komplementiert (komplementär zum Primer) und ist in den weiteren Zyklen ein Template mit 100%iger Homologie, sodass falsche Produkte im Verlauf der PCR zu leicht amplifizierbaren Produkten werden.
| | Nicki | 2008-11-22 23:16:15 |
Profil
Beitrag #5 • | Der letzte Satz klingt sehr logisch und danach würde es natürlich Sinn machen, dass die Wahrscheinlichkeit eines solchen Ereignisses bei sehr hoher Zyklenzahl ziemlich hoch ist.
Aber ich frage mich, ob die Wahrscheinlichkeit genau so hoch wäre, wenn ich sagen wir mal standardmässig 25 Zyklen mache, aber dafür vielmehr DNA einsetze?
Ich muss unbedingt in meiner Probe ein Produkt nachweisen, da ich bei 40 Zyklen und 0,5µl DNA aber gar nix gesehen habe, hatte ich dann halt schrittweise die Zyklenzahl erhöht, was dann aber lediglich zu einem Schmier führte.
Würde es mir vielleicht weiterhelfen, z.B 5 µl DNA einzusetzen und bei 30 Zyklen zu bleiben?
Ich dachte immer so eine PCR wäre sensitiv genug, um kleinste Mengen nachzuweisen?
Danke nochmal für deine Ratschläge... | | acribio | 2008-11-24 12:09:51 |
Profil
Beitrag #6 • | | Ich dachte immer so eine PCR wäre sensitiv genug, um kleinste Mengen nachzuweisen? |
|
Das ist oft das Problem, dass man die PCR stark überschätzt. Gehen Sie einfach mal davon aus, dass eine PCR relativ unsensitiv ist, dann liegen Sie besser. Geht man alle 3 Zyklen von einer Verdopplung der DNA-Menge aus, (und nicht in jedem Zyklus), dann haben Sie bei 30 Zyklen die DNA lediglich 10x verdoppelt. Das ist gar nicht sooo viel.
Ich würde Ihnen empfehlen mal mehr DNA einzusetzten, z. B. 2 oder 5µl. Das sollte falsche Produkte zurückdrängen, aber natürlich auf Salz/EDTA-Konzentrationen im Auge behalten (deshalb DNA möglichst nur in steril H2O lösen).
Die Wahrscheinlichkeit von falschen Produkten / Schmier steigt natürlich mit der Zyklenzahl. Schmier ist ein guter Grund die PCR abzuändern, und die Zyklenzahl zu reduzieren /DNA Menge zu erhöhen.
Wenn Sie jedoch bei 40 oder 45 Zyklen erst eine vernünftige Bande sehen und keinen Schmier (!) dann brauchen Sie sich keine Gedanken über zuviele Zyklen zu machen.
Wichtig ist meiner Meinung nach, die Annealing-Zeiten so zu gestalten, dass die Polymerase nicht bereits bei niedriger Temperatur mehrmals einen Strang durchlaufen kann. Dazu ist eben wichtig:
geringeres PCR-Volumen(10-20µl), dünnwandige Tubes, und dann ~15 sek Annealing (bei light-cyclern nimmt man teilweise bis zu 7sek!).
Dadurch steigt die Spezifität der PCR.
Manchmal sieht es im Vergleich zu einer "normalen" PCR jedoch so aus, als wenn die Ausbeute sinkt und deshalb muss man ein paar Zyklen nachlegen. Belohnt wird man aber durch eine hohe Sensitivität und Spezifität.
| | Nicki | 2008-11-24 14:30:01 |
Profil
Beitrag #7 • | So, habe das ganze nun mit 5 µl DNA (in H2O gelöst) und 30 Zyklen gemacht. Kein Schmier im Input, aber auch gar nix in meinen Proben. Das gleiche bei geringer Annealing-T und 20µl Reaktionen.
Da ist wohl einfach nichts drinn. Manchmal ganz schön zum verzweifeln :((( | | acribio | 2008-11-25 11:40:11 |
Profil
Beitrag #8 • | Na so ein Pech auch ;-(
Ich wollte Ihnen gerade noch vorschlagen die Annealing-Temp zu erniedrigen, aber das haben Sie ja nun auch schon durch.
Empfehlen würde ich auch eine Positiv-Kontrolle, d.h. eine Probe, bei der Sie wissen, dass Ihr Produkt herauskommen sollte.
Die Annealing-Temperatur sollte man durchaus 10°C niedriger ansetzen, als Tm (aber mindestens 42°C). Dadurch steigt die Ausbeute des richtigen Produkts meist stark an; stärker als unerwünschte Produkte.
Und zögern Sie nicht 35, 40 und 45 Zyklen zu probieren. 30Zyklen ist vermutlich zu wenig.
Und nochmals viel Erfolg ;)
| | Nicki | 2008-11-27 16:36:20 |
Profil
Beitrag #9 • | "Die Annealing-Temperatur sollte man durchaus 10°C niedriger ansetzen, als Tm (aber mindestens 42°C). Dadurch steigt die Ausbeute des richtigen Produkts meist stark an; stärker als unerwünschte Produkte."
Das ist mir noch nicht so klar. Umso tiefer die Annealing-T, desto besser können doch Primer binden, die keine allzu hohe Homologie aufweisen? Oder meinen Sie, weil bei niedriger Temperatur die Pol schlechter arbeitet und deshalb während dieser T keine falschen Amlifikate herstellt? Also funktioniert das nur bei sehr kurzen Schritten.
| | acribio | 2008-11-27 21:08:20 |
Profil
Beitrag #10 • | Hallo Nicki,
gut dass du noch x hereingeschaut hast, ich werde dazu morgen einen eigenen Thread aufmachen (aus purem Eigennutz ;-)).
| desto besser können doch Primer binden, die keine allzu hohe Homologie aufweisen? |
|
So müsste es sein, und so ist es auch. Aus diesem Grund erhöht man oft die Annealing Temperatur bei Problemen. Aber was erreicht man damit? Die Ausbeute sinkt, und zwar auch und besonders (!) die vom erwünschten Produkt. Diesen Effekt sieht man oft erst, wenn man mal (wie du jetzt) alle Register ziehen muss, um überhaupt ein Produkt zu bekommen.
| weil bei niedriger Temperatur die Pol schlechter arbeitet |
|
Die Polymerase hat bei 72°C ihr Optimum, aber sie verlängert die Primer auch bei der Annealing Temperatur. Die Geschwindigkeit sinkt nicht soo stark mit der Temperatur.
Übrigens wollte ich dich auch noch nach deinem "Schmier" fragen. Handelt es sich um die ~50-100bp Produkte unterhalb deines Zielfragments (sprich Primerdimere)?
| | Nicki | 2008-11-28 14:43:41 |
Profil
Beitrag #11 • | Meine Fragmente sollten so um die 500 bp groß sein, der Schmier ist bei einigen Proben 500 bp und kleiner, bei anderen mehrere kb groß. Wenn Schmier da ist, sollte das ja eigentlich ein Zeichen dafür sein, dass auch DNA vorhanden ist. | | Beiträge 1 bis 11 von 11 angezeigt. |
