Problem bei PCR |
| Nicki | 2008-11-12 13:32:38 |
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Beitrag #1 • | Hallo.
Ich habe folgendes Problem bei meiner PCR:
wenn ich eine PCR mit genomischer DNA mache, erhalte ich mein gewünschtes Produkt, ca.500bp.
Ich verwende einen 50µl Ansatz, und mache 25 Zyklen.
Nun versuche ich PCRs an immunoprezipitierter (ChIP) DNA durchzuführen. Um teilweise überhaupt etwas zu erhalten, bin ich nun mit der Zyklenzahl auf ca 60 hoch. Das Problem: ich erhalte nur noch ein Schmier, der meist unterhalb der Länge meines gewünschten Fragments liegt.
Kann mir jemand einen Tipp geben, woran das liegen könnte?
| | acribio | 2008-11-13 11:04:06 |
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Beitrag #2 • | Hallo Nicki,
Willkommen im Forum!
Gib doch bitte noch genauere Daten zur PCR an, genauer:
- Zykluslängen und Temperaturen
- Länge der PCR-Primer
- Art der Polymerase (Taq oder Proof reading...pfu etc.) - ich vermute mal aus Kostengründen Taq-Polymerase
Ich gehe mal davon aus, dass die von untersuchte DNA (zumindest in Kontrollproben) enthalten ist, so dass auf jedenfall Banden auftauchen sollten.
| | Nicki | 2008-11-14 13:38:54 |
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Beitrag #3 • | Hallo!
1. 94°C 2min
2. 94°C 30sek
3. (ca. 58°C) 45 sek
4. 72°C 2 min
2-4 50-65X
5. 72°C 5min
Die Primer 20 bp lang, Taq-Polymerase.
Habe vorhin in einem anderen Beitrag gelesen, dass meine Annealing-T vielleicht zu lang ist und werde es mal mit einer kürzeren versuchen, bloss die war bei den PCRs an genomischer DNA ja genauso lang. | | Nicki | 2008-11-14 14:52:19 |
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Beitrag #4 • | Ok, hatte die Annealing-T auf 20 sek reduziert, hat nix geholfen :( | | acribio | 2008-11-14 20:11:50 |
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Beitrag #5 • | Hallo Nicki,
Habe vorhin in einem anderen Beitrag gelesen, dass meine Annealing-T vielleicht zu lang ist und werde es mal mit einer kürzeren versuchen,
bloss die war bei den PCRs an genomischer DNA ja genauso lang. |
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also mit einer einfachen Änderung am Programm wird das glaub ich nix.
Das Programm ist ein übliches Programm, aber mit einem üblichen Programm gibts auch nur das Übliche: Schmier bei vielen Zyklen :D
Ein Programm sollte gut passen, dann kann man durch mehr Zyklen auch eine größere Ausbeute ohne unspezifische Banden erhalten.
Das ist bei dem Programm leider nicht der Fall.
Hier die Erklärung: Die Taq-Polymerase schafft ~20bp/sek, d.h. sie schafft deine 500bp in ~25sek !
Da kannst du dir also ausrechnen, was die Polymerase bereits in der Annealingphase schafft, nämlich weit mehr als einen Strang komplett.
In der Annealingphase ist aber noch von keiner spezifischen Bindung der Primer auszugehen, d.h. "Es wird irgendwas amplifiziert"
Ein weiteres Problem sind 50µl-Ansätze. Bis in den gesamten 50µl die Temperatur des PCR-Gerätes vorgedrungen ist, das dauert
seine Zeit. Deshalb hat man ja auch stets 1min Annealing-time und extension-time genommen.
Was kannst du also tun:
- Nimm Ansätze von max. 20µl besser 10µl und die 100µl tubes, die Dünnwandigen.
Nun zum Programm:
1. 94°C 2min (ist okay)
2. 94°C 30sek (ist auch okay, kann man bei 10µl auf bis zu 15sek kürzen)
3. (ca. 58°C) 45 sek (Da liegt dann der nächste Hase im Pfeffer.)
Mache Keine Kalkulation der Annealing-Temperatur!!
Nimmer stets ~42° oder ~45°
Begründung: Der Primer ist kurz, deshalb steigt die Bindung des Primers an seine homologe Sequenz auch unterhalb von Tm noch an.
Stattdessen eben die annealing-time kurz und knackig!
Also
3. 45°C 15sek (hier bei höheren Volumina die Zeit verlängern z. B. bei 50µl 20-25sek, nur bei längeren Primern (30-50bp) die temp höher )
4. 72°C 30sek (bei 500bp und Taq reicht das.)
2-4 30, 35, 40, 45 Zyklen probieren
5. 72°C 5min ( Kann man machen. Kann man glaub ich auch lassen.
Abschliessender 72°C Schritt soll die angefangenen Stränge vervollständigen. Hab gehört, dass es besonders zur Klonierung wichtig sei. Andere wiederum sagen es sei egal und überflüssig.
Einige meinen, dass hierbei A-Überhänge zur TA-Klonierung angehängt werden.)
Und nun noch zur Zykluszahl: Einige meinen, dass diese Zykluszahl ja Unfug sei, da bei >40 Zyklen ja alles Mögliche
amplifiziert wird.
Richtig ist: Die PCR ist bei Weitem nicht so effektiv in der Amplifikation wie man glaubt. Also eine Verdopplung ist
in jedem Zyklus ist Illusion. Es sind ~ 3Zyklen je Verdopplung der Menge, wenn es gut läuft (und das tut es ja nie laut Murphys-law)!
Wenn man die erheblich kürzeren Amplifikationszeiten beherzigt, dann muss man auch mehr Zyklen fahren. Der Untergrund (oder signal / noise-ratio)
ist deutlich verbessert und erlaubt auch mehr Zyklen, also ruhig mal 40, 50 60Zyklen probieren und nicht auslachen lassen.
So und nun wünsche ich viel Erfolg!
| | Nicki | 2008-11-16 15:30:51 |
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Beitrag #6 • | Vielen Dank für die Tipps!
Ich werde sie bald möglichst austesten. | | Beiträge 1 bis 6 von 6 angezeigt. |
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