Probleme mit qPCR |
| petra | 2008-06-25 13:35:05 |
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Beitrag #1 • | Ich habe RNA aus Hautbiopsien isoliert, dann mittels RT-PCR cDNA hergestellt und dann mit dem Taq-man System eine qPCR des Housekeeping Gens 18S RNA durchgeführt. Die Kurven liegen zu weit auseinander und bei einem Großteil der Proben ist der ct-Wert zu hoch. Kann mir jemand sagen, ob es sich in jedem Fall um Degradation handelt oder ob auch die Reinheit der Probe von Bedeutung ist, d.h. die Probe könnte etwas enthalten, dass die PCR stört?! | | acribio | 2008-06-25 14:47:12 |
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Beitrag #2 • | Hallo Petra,
ich kenne mich mit 18S RNA als Housekeeping Gen nicht so aus. Würde aber mal sagen, dass das wohl nicht der Grund sein wird.
Ich persönlich glaube, dass das das Taq-Man Prinzip per se ganz schön Fehleranfällig ist, die Sonden müssen schon gut sein.
Am allerhöchsten schätze ich den Wert von guter RNA ein. Hier liegt meist der Fehler. Ich würde empfehlen die Absorption und Ratio zu messen. Und wenn die gut ist, dann würde ich trotzdem noch ein RNA-Gel laufen lassen. Erst wenn ich im RNA-Gel keine Hinweise auf RNA-Abbau sehe, dann ist die RNA wirklich tauglich.
Ansonsten würde ich für Humanes / Eukariontisches Material "Die blaue Linie" empfehlen (bzw. rot), sprich Qiagen RNeasy, das klappt imho besser als wenn man Phenol-Präps macht. RNA mit Phenol-haltigen Reagenzien halte ich für geschickter, wenn man wenige Proben hat, und /oder viel RNA und die cDNA z. B. weiter klonieren/verarbeiten möchte.
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