Haushaltsgene bei der PCR |
| meret | 2008-05-15 09:04:14 |
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Beitrag #1 • | Guten morgen,
bin zum ersten Mal in diesem Forum unterwegs, vielleicht finde ich hier ja Hilfe :)
Ich bin auf der Suche nach einem geeigneten Haushaltsgen für meine RT-PCR. Die Zellen die ich verwende sind menschliche Makrophagen (U937-Zellen). Bisher war mein Haushaltsgen die allseits beliebte Gap-DH, aber die Werte schwanken bei mir zu sehr, deshalb habe ich jetzt TBP ausprobiert. Leider kommt das jetzt erst bei Cyclus 25 +. Meine Zellen sind auch ganz sicher am Leben, Trypan-Blau-Test.
Vielleicht hat ja jemand eine Idee was ich falsch mache oder was ich besser verwenden könnte.....
| | acribio | 2008-05-15 10:33:15 |
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Beitrag #2 • | Hallo Meret,
probieren Sie doch mal Cyclophilin.
Gruß
acribio | | acribio | 2008-05-16 09:51:59 |
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Beitrag #3 • | Fa. Ambion und einige andere bieten glaube ich käufliche Primerpaare dafür an | | acribio | 2008-05-16 09:57:38 |
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Beitrag #4 • | Das A und O für die RT-PCR ist die RNA.
Sie sollten vielleicht da Ihre Fehler suchen. Auf ein anderes Haushaltsgen umzuschwenken ist vielleicht nicht der richtige Weg ;) | | meret | 2008-05-16 11:10:17 |
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Beitrag #5 • | Vielen Dank für alle Antworten.
Meine RNA-Extraktion hat hat 260/280 Werte zwischen 1,7 und 2,0 und die Extraktionsmenge reicht aus. Hab übrigens bei der Abkürzung einen Fehler gemacht. Ich mache Real-time-PCR's keine RT-PCR's, ist aber auch zu verlockend diese Abkürzungen durcheinander zu schmeißen. | | meret | 2008-05-16 11:12:43 |
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Beitrag #6 • | Wo könnte denn sonst noch der Fehler "in der RNA stecken" | | acribio | 2008-05-16 11:34:39 |
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Beitrag #7 • | okay - real-time-PCR - aber so wie Sie es machen ists ja auch eine RT-PCR (reverse Transkriptase-PCR)
und RNA scheint auch i.o. . Vielleicht kann man die RNA trotzdem mal auf einem RNAGel (oder DNA-Gel, der einfachheit halber!) auf die beiden ribosomalen Banden überprüfen. Wenn da Schmier zu sehen ist, dann wirds nix, (auch wenn 260/280 ratio und Menge i.o. sind)
Na dann würd ich ruhig mal Cyclophilin probieren. das wir erheblich stärker als gapdh exprimiert und ist auch ein "housekeeping" Gen.
(mit der Sequenz kann ich leider grad nicht dienen) | | acribio | 2008-05-22 22:24:55 |
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Beitrag #8 • | Hier hab ich mal eine Übersicht über verschiedene housekeeping-gene gefunden.
http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/content/full/56/421/2907/TBL1
jetzt müsste man noch die entsprechenden Sequenzen von humanem Cyclophilin heraussuchen | | acribio | 2008-05-23 08:17:50 |
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Beitrag #9 • | So - ich habe mal recherchiert, und mache dir einen Vorschlag:
Nimm diese Primer:
forward: cccaacacaaatggttcccag
reverse: cctccacaatattcatgcctt
die amplifizieren ein ca. 100bp großes DNA-Stück der codierenden Region dieses humanen cyclophilin A: NM_021130
Die codierende Region (cds) CDS ist von Base 84 bis Base 581
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val=114520617
| | acribio | 2008-05-23 08:29:43 |
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Beitrag #10 • | Hier die Alignments (wurden durchgeführt mit dem Staden-Package). Die Sequenz des reverse-Primers wurde zuvor complementiert
Forward-primer-Alignment
301 311 321 331 341 351
cyclophilin.seq ctggtggcaagtccatctatggggagaaatttgaagatgagaacttcatcctaaagcata
cycloph-fwd.seq ............................................................
- - - - - -
361 371 381 391 401 411
cyclophilin.seq cgggtcctggcatcttgtccatggcaaatgctggacccaacacaaatggttcccagtttt
|||||||||||||||||||||
cycloph-fwd.seq ...................................cccaacacaaatggttcccag....
- - - - 6 16
421 431 441 451 461 471
cyclophilin.seq tcatctgcactgccaagactgagtggttggatggcaagcatgtggtgtttggcaaagtga
cycloph-fwd.seq ............................................................
- - - - - -
481 491 501 511 521 531
cyclophilin.seq aagaaggcatgaatattgtggaggccatggagcgctttgggtccaggaatggcaagacca
cycloph-fwd.seq ............................................................
- - - - - -
Reverse-primer-Alignment (wurde zuvor complementiert)
421 431 441 451 461 471
cyclophilin.seq tcatctgcactgccaagactgagtggttggatggcaagcatgtggtgtttggcaaagtga
cycloph-rev.seq_ ............................................................
- - - - - -
481 491 501 511 521 531
cyclophilin.seq aagaaggcatgaatattgtggaggccatggagcgctttgggtccaggaatggcaagacca
|||||||||||||||||||||
cycloph-rev.seq_ ...aaggcatgaatattgtggagg....................................
- 8 18 - - -
541 551 561 571 581 591
cyclophilin.seq gcaagaagatcaccattgctgactgtggacaactcgaataagtttgacttgtgttttatc
cycloph-rev.seq_ ............................................................
- - - - - -
601 611 621 631 641 651
cyclophilin.seq ttaaccaccagatcattccttctgtagctcaggagagcacccctccaccccatttgctcg
cycloph-rev.seq_ ............................................................
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