Labelling für eine FISH Sonde |
| Stine | 2008-04-21 11:07:41 |
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Beitrag #1 • | Hallo Ihr alle,
ich habe ein Problem mit dem Basteln einer FISH Sonde.
(aus aufgereinigten PCR Template mit CY3 bzw dUTP)
Unser Problem dürfte ein Problem mit der Markierung an sich sein.
Alle anderen Fehlerquellen sind so ziemlich ausgeraumt.
Es geht also eigentlich um den Schritt der Aufreinigung und wie dieser Schritt das labelling beeinflußt. Cy3 ist eine reine Markierungsreaktion, dUTP eine enzymatische. Und beide binden wenn überhaupt zu schwach an dem Template.
Hat jemand Erfahrungen damit oder kennt jemand Arbeitsgruppen oder Paper die damit sich beschäftigen.
Das wäre klasse.
Erstmals vielen Dank Stine | | acribio | 2008-05-05 23:05:14 |
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Beitrag #2 • | Hallo Stine!
Eine stichpunktartige Zusammenfassung unseres Telefonats:
- Das Labelling der Sonde lässt sich überprüfen, in dem man einen kleinen Aliquot der Reaktion
auf einem Agarose-Gel aufträgt und nachschaut, ob die Zielbande markiert ist bzw. fluoresziert.
- Eine Abtrennung der markierten Sonde von nicht eingebauten Markerbausteinen, lässt sich
durch Größenausschlußchromatographie leicht erreichen. Diese kann in Spin-column-Säulchen
in Eppendorf-Einmal-Gefässen stattfinden. Ein Beispiel Fa. Genaxxon BioScience:
CentriSpin 20 Säulchen für DNA, RNA und Proteinreinigung
- Eine DNA-Fällung sollte ebenfalls eine Abtrennung der nicht eingebauten Markerbausteinen
bewirken. Bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Primern jedoch ist die Größenausschlußchromatographie
zu bevorzugen.
- Cy3 makierte Sonden und Primer lassen sich direkt herstellen, z.B. von der Firma Biomers (www.biomers.net):
Ausgewählte 5'- Fluoreszenz- markierungen
Vielleicht helfen diese Informationen...
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