Schmier in der PCR |
| Nobi | 2008-03-18 17:13:36 |
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Beitrag #1 • | Habe bei meiner PCR mit Pfu-Polymerase einen Schmier von oben bis unten erhalten. Was könnte die Ursache sein. Habe 100 pmol Plasmid-DNA und 2 units Pfu eingesetzt.
Bei einer vorab durchgeführten PCR mit Taq habe ich keinen Schmier erhalten.
Die Annealingtemperatur liegt bei 50°C. die Denaturierung bei 94°C.
Habe schon mal gehört, dass Pfu die Primer verdaut, wenn man die PCR Reaktion zu lange stehen läßt. Könnte das eine der Ursachen sein.
Hat jemand eine Idee, was ich anders machen sollte?
Gruß
Nobi | | acribio | 2008-03-18 20:29:16 |
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Beitrag #2 • | Hallo Nobi,
>Schmier von oben bis unten
vielleicht besser einen Overall benutzen. :D
Na Scherz beiseite. Herzlich willkommen im Forum.
>Habe schon mal gehört, dass Pfu die Primer verdaut,
hm das habe ich noch nicht gehört, kann mich nicht erinnern.
Hast du denn bei deiner vorher mit Taq durchgeführten PCR das gleiche Programm beim PCR-Gerät eingestellt.
Das wäre nämlich ungeschickt. Für taq und pfu sollte man stets eigene Programme nehmen.
Wie ist denn dein PCR-Programm?
| | acribio | 2008-03-25 20:21:21 |
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Beitrag #3 • | Sie haben vorab eine PCR mit der Taq-Polymerase durchgeführt.
Sie dürfen aber keinesfalls das gleiche PCR-Programm für die pfu-polymerase nehmen, welches Sie auch für die Taq-Polymerase verwendet haben!
Sie müssen eine längere Extension Time nehmen! Sie müssen für die pfu etwa ~ 6bp/sek je base des PCR-Produktes rechnen. Für die Taq-Polymerase können die Extension-Zeiten erheblich kürzer sein, da diese etwas ~20bp/sek schnell ist. sollten ihre Extension time für die Taq-Polymerase in diesem Sinne "viel zu lang" sein, so müssen Sie damit rechnen, dass die Taq mehrfach über Ihr Produkt "polymerisiert" und deshalb auch mehr Produkt entsteht. Wenn Sie jetzt z. B. im unten beschriebenen Sinne die Extension-time für die Taq-Polymerase verringern, dann erhalten Sie trotz des "besseren" PCR-Programms möglicherweise weniger PCR-Produkt. Dies können Sie wiederum ausgleichen, in dem Sie die Zahl der Zyklen deutlich steigern (z. B. ->40 und mehr). Wenn Sie in diesem Sinne arbeiten, werden Sie auch mit der Taq und pfu vergleichbare Ergebnisse erzielen.
Beispiel: PCR-Produkt-Länge: 500bp
Volumen 10 - 20µl
Taq- PCR:
Denaturierung: 95 °C 10-15sek
Annealing: 45 ° C 15sek
Extension-time: 72 ° C , 25sek ( = 500bp / (20sek / bp))
pfu- PCR:
Denaturierung: 95 °C 10-15sek
Annealing: 45 ° C 15sek
Extension-time: 72 ° C , 85sek ( = 500bp / (6sek / bp)) !!
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