Auswertung einer Chromatin-Immunopräzipitation |
| Shaun | 2008-03-04 21:01:40 |
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Beitrag #1 • | erstmal ein freundliches hallo an alle! :)
leider habe ich ein kleines verständnis-problem bei der auswertung einer ChIP.
der versuch ist folgender: ich möchte die chromatinmodifikation eines gens in zwei verschieden transfizierten ansätzen untersuchen.
dazu führe ich die ChIP nach protokoll durch und mache anschließend eine realtime-pcr mit je input und eluat der beiden samples.
ich verwende primer, die spezifisch für mein zu untersuchendes gen sind, sowie primer für ein haushaltsgen.
mit den daten der realtime-pcr des haushaltsgens normalisiere ich die daten des ziel-gens. danach sollte doch die dna-ausgangsmenge der beiden samples angeglichen sein, und ich kann ihre werte miteinander vergleichen.
nur frage ich mich, wie jetzt der INPUT in die rechnung einfließt.
soll er mir nur einen anhaltspunkt geben, wie effektiv die präzipitation war?
vielen herzlichen dank für vorschläge und verständnishilfen! | | acribio | 2008-03-04 22:30:44 |
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Beitrag #2 • | Ein freundliches Willkommen Shaun!
Puh :p da muß erstmal einer durchsteigen :-)
In der von dir genannten Methode Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) bin ich wahrlich kein Fachmann, ich hoffe, dass sich noch jemand hier findet, der da mithelfen kann ;)
Aber eine Idee hab ich doch:
Mit der Normalisierung der realtime-PCR auf das Haushaltsgen sollen die Ergebnisse nur von den Fehlern, die durch die PCR entstehen bereinigt werden. Du musst die Ergebnisse m.E. ZUSÄTZLICH auf die DNA-Ausgangsmenge beziehen, bzw. auf den INPUT normalisieren.
| | acribio | 2008-03-05 10:34:26 |
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Beitrag #3 • | Ein Beispiel: Du hast 2 PCR-Proben mit dem gleichen DNA-Gehalt. Dennoch läuft die PCR unterschiedlich, (die Polymerasen in Topf 1 haben einfach keine Lust zu arbeiten)
Dies passiert genauso bem housekeeping Gen. Durch die Normalisierung auf das housekeeping gen ist dieser Fehler bereinigt (oder verringert - wie mans nimmt). Eine unterschiedliche DNA-Menge ist hierbei noch gar nicht berücksichtigt.
| | Shaun | 2008-03-06 16:20:51 |
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Beitrag #4 • | wow, vielen dank für die schnelle antwort!
das klingt alles sehr einleuchtend und hat mich schon ein riesen-stück weitergebracht.
leider habe ich auch noch schwierigkeiten bei der mathematischen auswertung...
zur normalisierung auf das housekeeping-gen subtrahiere ich die ct-werte des hk-gens von denen der jeweiligen proben.
bei der normalisierung auf den input berechne ich zuerst das verhältnis von input(sample) zu input(kontrolle) und korrigiere dann mit diesem faktor den ct-wert meines ChIP-samples? macht das soweit sinn?
oder wird damit erst am schluß der delta-delta-ct-wert korrigiert?
ich seh schon, fürs ChIPn bin ich definitiv nicht beboren...
aber nochmals vielen dank für denkanstöße!
| | acribio | 2008-03-15 10:56:21 |
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Beitrag #5 • | Vielleicht kann dir ja diese Frau helfen:
www.chemieonline.de/forum/showthread.php?t=58000
oder dieses Protokoll:
www.molecularstation.com/de/protocol-links/DNA-Protocols/Chromatin-Immunoprecipitation-Protocols/ | | Beiträge 1 bis 5 von 5 angezeigt. |
