Primer designen |
| Backe003 | 2008-03-02 15:21:42 |
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Beitrag #1 • | Hallo,
nun werde ich nicht drum rum kommen, mir für eine reverse Transkriptase PCR selbst Primer designen zu müssen. Leider hab ich keine Ahnung, wie das genau funktioniert bzw. ob die Primer, welche mir die Software ausspuckt funktionieren (spezifisch sind). Bisher bin ich so weit, dass ich mir die Nucleotidsequenz des Gens suche, für das ich die Primer benötige. Die FAST Daten habe ich dann in eine free Software kopiert und mir wurden die Primer ausgespuckt. Die Primersequenzen habe ich dann nochmal geblastet, um zu sehen ob sie auch an andere Gene wie mein Zielgen binden, das war aber anscheinend weniger der Fall. Aber so einfach kann das doch nicht gehen? Primer designen soll ja sehr viel Erfahrung erfordern...
Vielleicht könnte mir jemand kurz einen Crashkurs geben bzw. eine Übungsaufgabe?
Das wäre total nett!
Viele liebe Grüße! | | acribio | 2008-03-02 19:40:39 |
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Beitrag #2 • | Hallo Backe!
Na das hört sich doch schon ziemlich ausgebufft an!
>Primer designen soll ja sehr viel Erfahrung erfordern
hm - wieso?
Übung macht den Meister, ich finde du hast das schon sehr gut gemacht. Mit einer Software. Was aber noch besser ist: Deine Kontrolle mit blast!
Was ich in deinem Fall für wichtig erachte: Wähle die Primer nie zu kurz also ruhig über 20 bp also z. B. 23 - 25 bp, dann hast du nie Probleme mit der Spezifität. Du kannst dann auch eine ausreichend hohe Annealing-Temperatur wählen. Aber auch die Annealing-Temperatur ist eigentlich unkritisch. Ich würde stets 45-50° C empfehlen. Wichtig bei der Annealingphase ist vielmehr, dass sie nicht zu lang ist, also 15-25sek reichen aus, je nach PCR-Volumen (je mehr je länger). Denn sonst rast die Taq-Polymerase schon in der Annealing-phase mehrmals über das Produkt.
Viel Erfolg!
Wähle auch das PCR-Produkt nicht zu lang und passe die Extensiontime vernünftig an die Produktlänge/Polymerase an.
| | acribio | 2008-03-04 16:17:15 |
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Beitrag #3 • | erzähl doch x was über deine PCR. Produktlänge etc. Temperaturen und Zeiten...
| | Backe003 | 2008-03-23 10:53:54 |
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Beitrag #4 • | Danke erstmal für die schnelle Antwort!
also, ich bin, wie schon gesagt auf der Suche nach verschiedenen one step reverse Transkriptase PCR Primern. Mittlerweile habe ich mich am Primerdesign des Houskeeping Gens GAPDH versucht. Dabei hat mir das Programm folgende Primer vorgeschlagen:
OLIGO start len tm gc% any 3' seq
LEFT PRIMER 3581 20 60.11 50.00 8.00 1.00 AGGGCCCTGACAACTCTTTT
RIGHT PRIMER 3811 20 59.99 55.00 4.00 2.00 AGGGGTCTACATGGCAACTG
D.h. Länge der Primer wählt das Programm meistens 20 bp aus, und auch die Schmelztemperatur liegt immer so um die 60°C. Das Produkt soll also 231 bp lang sein.
Zum Ablauf der PCR :
während meiner Diplomarbeit habe ich schon eine RT PCR gemacht, da hatte ich die Primer aber nicht selbst designed. Dabei hatte ich mich an das Protokol des One step PCR Kits gehalten, hat auch immer gut funktioniert.
Reaktionsansatz Menge [µl]
Wasser variabel
5 x OneStep RT-PCR Buffer (mit 12,5 mM MgCl2) 10
dNTPs (je 10 mM) 2
Template (1,5 µg) variabel, je nach Konzentration
Primer 1 (0,6 µM ) variabel, je nach Konzentration
Primer 2 (0,6 µM) variabel, je nach Konzentration
OneStep RT-PCR Enzym Mix 2
Gesamtvolumen 50
Dauer [min] Temperatur [°C] Zyklen
Reverse Transkription 30 50
Initial PCR activation step 15 95
Denaturation 1 94 30
Annealing 1 56 bzw. 52
Extension 1 72
Final extension 10 72
Primär hätte ich wahrscheinlich das gleiche Programm verwendet,die Annealingtemperatur entsprechend den Primern 5°C unter der tm gewählt.
Nach dem Primerdesign habe ich die Primer nochmal über Blast getestet, dort konnte jedoch nichts gefunden werden (no significant similarity found). Das hat mich etwas verwundert. Vielleicht sind sie doch etwas zu kurz?
Vielen Dank für Ihre Hilfe, es ist schon toll, dass man über ein Forum so gut beraten wird ;-)
| | acribio | 2008-05-07 21:01:31 |
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Beitrag #5 • | Au Backe :D - erst jetzt gesehen, dass Sie geantwortet haben.
>hab ich mich am Primerdesign des Houskeeping Gens GAPDH versucht.
Nimm doch einfach standard Primer ;) oder - ich nenne dir die Sequenzen. Ich habe damals mit einem Paar gearbeitet, das überspannt ein kleines Intron, so dass man die DNA-Verunreinigung auch mit amplifiziert, welche dann als größere Bande erscheint! (Funktionierte nur in der Theorie :D)
Hm - also das sind wohl Primer für humanes Gapdh??
Find ich ungewöhnlich, humanes Material ist eher selten, Sie verwenden vermutlich Zelllinien, oder Blutzellen?
Zur PCR würde ich sagen, es handelt sich um eine Standard-PCR
denaturation 1min, annealing 1Min extension 1min
das ist nicht so gut! (denke ich)
denn:
Die Taq-Polymerase (und die ist vermutlich in dem rtMix, da Sie ja einen Aktivierungsschritt haben der wohl den taq-Antikörper inaktiviert)
braucht bei 72°C für 20bp nur ~1sek !
Ihr PCR-Produkt von 231 bp ist also in knapp 25sek fertig. Das Bedeutet für Ihre PCR schon in der Annealingphase!! (auch wenn man berücksichtigt, dass die Polymerasen bei der Temp. nicht Ihr Optimum hat.
Sie können die Annealing-Time auf 20sek reduzieren und die extension time ebenfalls. Damit die Ausbeute größer wird, können Sie wieder ein paar Zyklen mehr machen (z. B. 40-46) Berücksichtigt ist hierbei schon das rel. große Volumen von 50yl, Ich mache 10yl pcrs
und nehme 12-15sek annealing. Bei Lightcycler(TM) PCRs wird 7sek! annealing time genommen (sonst ist die PCR zu weit gelaufen und die TAQ-Man(R) Sonde kann nicht mehr binden).
Wenn Sie das in etwa beherzigen, dann sind viiiieeele andere Parameter nebensächlich. Dann können Sie jede Sequenz aus dem Gen nehmen, die sie möchten. Ich hab schon lange nicht mehr so Primer ausgesucht, wie Sie (Diese GC Kurven - vergessen sie die einfach). Achten Sie lieber darauf, dass nicht zuviele Wiederholungen drin sind (GGGCCC oder ttt) und die Sequenz "so unique" wie möglich ist, sonst wird die Wahrscheinlichkeit größer, dass es in anderen Genen ebenfalls vorkommt. Der Genblast (siehe unten) scheint mir doch noch einige andere Homologien zu zeigen.
20bp, das sollte eigentlich in jedem Fall okay sein.
Ich würde trotzdem empfehlen ruhig ein paar mehr zu nehmen.
So zwischen 22-25. Dann haben Sie auch weniger Probleme mit homologen Sequenzen.
Meine Erfahrung ist, dass die Annealing-Temperatur unkritischer ist, als Sie vermuten. Das Problem ist eher, dass sie bereits 1minute bei Annealingtemperatur eine PCR durchführen und da bei wird erhebliche Menge an unspezifisch gebundenen Primern elongiert.
Wenn Sie die Annealing Zeit kürzer wählen, dann können Sie von 45°C - zur Tm alles nehmen und Sie werden fast nur spezifische Produkte erhalten. (Denn die Tm ist ja die Temperatur an der 50% des Primers noch gebunden ist, also auch oberhalb von Tm ist noch Primer gebunden). Ich nehme fast nur 45°C
Blast:
hier (auf nucleotide blast klicken): www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi
Die Sequenz eingeben, und ganz unten auf Blast klicken.
Ich habe das mit Ihren Sequenzen getan, es kommt humanes gapdh heraus, auch anderes.
Ich werde mal die Gapdh-primer paare heraussuchen, und hier einstellen, wenn ich das schaffe.
Ansonsten viel Erfolg und danke für Ihr Lob! ;)
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