PCR mit add-on-primern |
| barlabor | 2008-02-19 17:08:24 |
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Beitrag #1 • | Hallo,
ich möchte ein (ca. 750bp langes) DNA-Fragment amplifizieren und mithilfe von add-on-primern 80bp bzw. 150bp an die Amplifikate dranklonieren. Bisher habe ich das in mindestens drei PCR-Schritten gemacht, wobei die add-on-Bereiche der Primer jeweils nicht länger als 30 Nukleotide lang waren. Leider war das Ergebnis nicht so berauschend, da sehr viele Mutationen aufgetreten sind. Ich benutze eine Polymerase mit proof-reading, aber die PCRs haben durch das schrittweise anhängen von Nukleotiden mindestens 90 Zyklen durchlaufen.
Jetzt die Frage: Wie lange könnte der nicht-hybridisierende Bereich eines add-on-Primers maximal sein, damit ich ein spezifisches PCR-Produkt erhalte, aber eben möglichst nur ein PCR durchlaufen müsste? Meint ihr, ich könte einen Primer verwenden, der alle 150bp in einem Schritt anhängt?
Vielen Dank schonmal im Voraus für eure antworten.
barlabor | | acribio | 2008-02-19 19:06:03 |
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Beitrag #2 • | Hallo barlabor,
soweit ich weiss, sollten 80bp addon problemlos herstellbar sein, mit dem 150iger wirds wohl schwieriger, ich selbst habe mal einen 120bp -Primer herstellen lassen, das war aber auch das äusserste.
ich würde bei dem 150bp addon vielleicht doch ein 2Schritt weg wählen (aus einem Vektor ausschneiden geht nicht?)
> Viele Mutationen
hm also mit Primern hab ich da noch nicht so die Probleme gehabt.
Hast du auch 2.5-3min extension time ?
>Wie lange könnte der nicht-hybridisierende Bereich eines add-on-Primers maximal sein?
Vermutlich denkst du, dass die Mutationen auch durch die Länge des Primers auftreten, da das Annealing etwas schwieriger wird.
Das stimmt schon. Aber du willst ja ein PCR-Produkt amplifizieren und nicht eine seltene cDNA eines Gens.
Mit längeren Primern muß man auch das Annealing genauer unter die Lupe nehmen: Nimm also mind. 25 bp homologe/komlementäre Sequenz zum PCR-Produkt (oder etwas mehr) und dann die Annealing-Temperatur rel. hoch wählen. z. B. 50° C. Die Annealing-Zeit würde ich dann auch nicht zu kurz wählen. In dieser Zeit hat der Primer noch die Möglichkeit die genaue Position zu finden. z. B. 20-30sek .
Die Zahl der Zyklen sollte man auch nicht zu hoch wählen, wenn man ein PCR-Produkt amplifizeren will, dass noch kloniert werden soll. Versuche unter 27 Zyklen zu bleiben.
All diese Tipps dienen dazu die Mutationen zurückzudrängen.
Ich hoffe ich konnte dir etwas helfen ;)
Gruß
| | barlabor | 2008-02-20 10:03:50 |
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Beitrag #3 • | Hallo Acribio,
vielen Dank für die schnelle Antwort. Ich werde die Sache dann mal nach deinen Tipps angehen.
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