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PCR-Optimierung

Chrischi2013-10-07 14:18:19

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Beitrag #1
Hey Leute,

Ich habe eine PCR gemacht und die Bande, die ich auf dem Gel erhalten habe daraufhin extrahiert, um dann eine weitere PCR zu machen. Bei der 2. PCR sollten eigentlich Produkte verschiedener Längen entstehen, sodass natürlich mehrere Banden sichtbar werden, (genauer sind die Amplikongrößen: 763/1776/2710/3682). Als Ergebnis habe ich jedoch NUR die 763-Bande bekommen. Habe es schon versucht indem ich die Primerkonzentration und die Magnesiumchloridkonzentration erhöhte, jedoch ohne Erfolg, es taucht immer nur die 763-Bande auf.

Hat jemand eine Idee? Ich würde mich über jeglichen Rat sehr freuen.
acribio2013-10-07 16:35:30

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Beitrag #2
Das wundert mich nicht...
ich habe am Ende immer PCR-Fragmente der Größe
100bp, 200 bp, maximal 300 bp gemacht
acribio2013-10-07 16:43:15

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Beitrag #3
>habe schon die MgCl2 Konz erhöht

auf das Naheliegendste kommt niemand. Eine Bande von 763bp braucht (mit Taq ~20bp/sek) 38.2 sek
Ein PCR Fragment von
1776bp braucht mit Taq 88.8 sek =1min 28,8 sek
2710bp braucht mit Taq 135,5 sek ) 2min 15,5 sek
3682bp ...... 184,1 sek = 3min und 4sek

zum Vergleich:
eine PCR-Bande mit 3682bp mit pfu (~5-6bp/sek)
benötigt an Elongationszeit sage und schreibe: 736,4 sek = 12min 16,4 sek
Hast daran schon mal gedacht? (die Elongationszeit bei 72° daraufhin zu verändern? )
macht fast niemand
Chrischi2013-10-08 09:10:54

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Beitrag #4
Vielen dank schonmal für den Tipp, ich werde es die Tage mal versuchen und melde mich dann nochmal! =)
Chrischi2013-10-08 10:11:14

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Beitrag #5
Eine Frage noch, hast du evtl. eine Quelle, wo diese spezifischen Elongationszeiten zu finden sind?

Vielleicht noch erwähnenswert, der Mastermix den ich benutzt habe war wie folgt:

je Probe:

10,75 µl RNAse-freies Wasser
1,5 µl DMSO
5 µl Puffer mit MgCl2
0,5 µl dNTPs
0,25 µl Expand Enzym
Chrischi2013-10-08 10:49:07

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Beitrag #6
das Programm dazu :

(Deckelheizung 111°C)
94°C 5:00 min
45 x [ 94°C 30 sek, 61°C 30 sek, 68°C 5min]
68°C 7min
(4°C )

acribio2013-10-08 11:06:41

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Beitrag #7
Taq:
http://de.wikipedia.org/wiki/Multidisplacement_Amplification


1000 - 2000 bp /min

heißt :
16.7- 33,3 bp / sek
Woanders habe ich Werte von 20-25bp/sek gelesen

Pfu:
The elongation velocity is 0.2~0.4kb/min (70~75°C).

hier: http://www.gbiosciences.com/ResearchProducts/Pfu-Polymerase.aspx

200-400bp/min
heißt:

3,33-6,7bp/sek

Daß das aber bedeutet, dass man die Elongationszeit bei pfu tatsächlich auf
12 min erhöhen sollte, wenn man mehrere kB (fehlerfrei) amplifizieren möchte,
darauf kommt man nicht. Ist vielleicht auch nur meine Meinung.

Kürzere Elongationszeiten bedeuten selbstverständlich nicht, daß keine Banden kommen.
Es handelt sich dann um eine Elongation in Etappen. Längere Stänge werden nicht in einem
Schritt amplifiziert, sondern mehrfach denaturiert,
re-annealed und dann erneut prolongiert.
Dies geht meiner Meinung nach extrem auf die Performance, Signal Noise Ratio
und führt in aller Regel, wenn nicht zu Fehlerbanden, dann zu deinem Ergebnis, also KEINE Banden.
Längere Amplifikate können meiner Meinung nach auch nicht so gut re-annealen in kurzer Zeit. Fazit: Alles wird schlechter.

Im gleichen Atemzug sollte man die Annealing-Time auf das notwendige Maß beschränken und
das sind fast nie mehr als 7-15sek!
Das sind übrigens die Werte, die man in Lightcycler-PCRs verwendet.

Wenn man dann noch (neben der angepassten Elongationszeit) die Polymerase erst
nach 15-20 sek Erstdenaturierung hinzugibt, dann hat man eine sehr hohe "Rauschunterdrückung" (Spezifität)
und kann auch die Zyklenzahl auf zB. 35-45 erhöhen, was durchaus nötig sein kann.
acribio2013-10-08 11:17:50

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Beitrag #8
Nimmst du denn Taq? Oder eine proof-reading Polymerase?

Nimm als Annealing Temperatur nicht mehr als 45° dann allerdings die Annealing-time nicht zu lang, sonst kommen wieder Unspezifitäten hinein.
15-20sek Annealing Temperatur reichen - 30sek ist aber glaub auch okay.
95° brauchst nur 10-15sek, 30sek ist aber auch okay.

Die Idee hinter der hohen Annealing-Temperatur damit die Spezifität erhöhen zu wollen, geht meiner Meinung nach an der Realität vorbei.
Tm heisst übrigens Schmelzpunkt und der wiederum ist definiert als die Temperatur bei der 50% gebunden sind und 50% eben nicht.
Was soll es, dass man einen halb herumwedelnden Primer elongieren möchte. Warum darf der nicht fest binden, was er bei 45° immer tut.
Der bindet bei 45° auch nicht wesentlich unspezifischer. Dazu sollte er aber mindestens so 23bp -25bp haben! eine hohe Spezifität entsteht dadurch, dass ich den Primer etwas länger wähle!! Dann kann ich auch die Annealing-Temp reduzieren. Die Probleme handelt man sich durch zu lange Annealingzeiten, zu kurze Primer und die oben beschriebene Etappenartige Amplifikation von langen Produkten.
Chrischi2013-10-08 12:33:37

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Beitrag #9
ja das es ist das "Expand High Fidelity Plus PCR System"-Kit von Roche und beinhaltet Taq-Polymerase.

Habe jetzt erstmal die Parameter am PCR-Programm geändert, mal schauen was dabei herauskommt.
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