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Ligation in Agarose Gel überprüfen

Martin2013-08-07 12:09:07

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Beitrag #1
Ich habe eine Ligation gemacht und diese nun in einem Agarose Gel überprüft, weil die bisherigen Transformationen nicht geklappt haben.
Mein Insert hat eine Größe von 1,5 kb und der Vektor ca 3 kb. Ich sehe drei Banden und zwar bei 1,5 kb, 3 kb und eine bei 4,5 kb. Soweit so gut, aber warum sehe ich bei 4,5 kb überhaupt eine Bande? Bei einer erfolgreichen Ligation hätte ich einen Schmier oder ähnliches erwartet. Kann es sein, dass der Vektor nur auf einer Seite ligiert wurde?
acribio2013-08-07 20:44:06

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Beitrag #2
Hallo Martin,

zuerstmal kannst dich über die gelungene Ligation freuen!

Deine Frage könnte ich mit einer Gegenfrage beantworten:

Wieso sieht man überhaupt noch 1.5 kb und 3kb Banden?!

Bei einer erfolgreichen Ligation könnte man erwartet, dass kein Insert und kein Vektor mehr übrigbleibt, sondern nur noch das Produkt... :-)

Aber das ist natürlich Unsinn. Es bleibt sicher immer unligierter Vektor und Insert übrig. Und ...
natürlich auch 1x ligiertes ... was du als 4,5 kb Bande siehst.

Was du als Schmier erwartest, das ist vermutlich so wenig, dass du es ÜBERHAUPT NICHT siehst. Du meinst vermutlich, dass die vollständig ligierte Variante, da ringförmig keine klare Bande mehr geben dürfte.

Die Wahrscheinlichkeit, dass ein 1x ligiertes ein weiteres Mal korrekt ligiert wird ist eh recht (seeehr) klein.
Viele meinen, dass man die Ligation sehr verdünnt ansetzen muss, damit die Wahrscheinlichkeit, dass falsche Enden ligiert werden, sinkt und damit die Wahrscheinlichkeit, dass richtige Enden zusammenkommen steigt. Das ist theoretisch richtig, aber es gilt trotzdem die Regel: Viel Edukte gibt auch viel Produkt. Also: viel Insert, viel Vektor und viel Ligase nehmen, dann klappts viel leicht. :)




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