PCR Protokoll für Molekularbiologie Praktikum - ein paar Fragen |
| bibabuu | 2012-02-22 10:47:27 |
Profil
Beitrag #1 • | Hallo an alle!
ich bin neu hier und bräuchte dringend ein bisschen Hilfe. Ich hatte in meinem Studium vor kurzem ein Molekularbiologie Praktikum. Jetzt habe ich das Protokoll zurückbekommen und soll vorallem die Diskussion verbessern. Jedoch fehlt mir teilweiße die nötige Kenntnis, um alles zu verstehen und entsprechend diskutieren zu können.
Also wir haben genomische DNA und mRNA aus EDTA Blut isoliert. Zunächst haben wir die Konzentration der DNA mittels Photometer bestimmt. Danach haben wir eine Mikrosatelitten PCR durchgeführt um eine short-tandem-repeat sequenz zu amplifizieren.
Mit Hilfe eines Kits haben wir mRNA aus dem Blut isoliert. Zunächst wurde die mRNA mittels RT PCR in cDNA umgeschrieben. Nach dem wir die cDNA hatten wurde damit eine PCR auf GAPDH durchgeführt. Mittels der PCR wurde ein Genausschnitt der für das Gen GAPDH codierenden cDNA amplifiziert. Im Anschluss haben wir alles mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Wir haben folgende Ergebnisse erhalten:
bei der RNA eine Bande bei etwas unter 2.000bp
GAPDH eine Bande bei etwa 450bp
DNA eine Bande bei etwa 20.000bp
Die anderen Proben lieferten keine Bande
es wäre sehr nett wenn ihr meine folgenden Fragen bald beantwortet könntet!
1. Warum erwarten wir ein Fragment von 450 bp bei der GAPDH-PCR?
2. Warum erwarten wir eine Bande von etwa 2000 bp bei der mRNA?
3. Was können wir über das housekeeping-Gen sagen, welche Fragmentlänge hätte man erwartet?
4.was bedeutet eine Expression des Gens?
5. Oder die STR-PCR, welche Fragmentlängen kommen innerhalb der Bevölkerung vor, wozu dienen STR-PCRs?
So das wäre vorerst alles!
Vielen Danke schonmal für eure Hilfe
Viele Grüße
bibabuu
| | BeckerFollmann | 2012-02-22 20:26:18 |
Profil
Beitrag #2 • | Hallo,
da stimmt was nicht bei Deinen Angaben.
Das PCR-Produkt aus der cDNA muss immer kleiner, als das der genomischen DNA sein (die Introne feheln bei der cDNA). Also sollte es umgekehrt sein, 450 bp cDNA und 2000 bp gDNA. DNA-Bande bei 20.000 bp ist sicherlich kein Praktikums-PCR-Produkt.
Falls Du die Primer-Sequenzen hast, kannst Du das Ergebnis mittels einer BLAST Analyse nachanalysieren (Google-> NCBI-> BLASTN, Primer eingeben und Mensch-Datenbank auswählen und mit etwas Geduld durchhangeln, aus der Nummerierung kann man die Fragmentgrößen berechnen).
Das Housekeeping Gen ist exprimiert in Blutzellen.
STR-Analysen dienen z. B. für Vaterschaftstests, die Allelverteilungen kann man aus entsprechenden Datenbanken ziehen. Siehe hier http://www.uni-duesseldorf.de/WWW/MedFak/Serology/seronews-Dateien/teil_3.pdf.
Gruss JBF | | acribio | 2012-02-23 09:37:10 |
Profil
Beitrag #3 • | Super! Dass hier schon so etwas wie eine Diskussion entsteht!!
Vielen Dank!
| | acribio | 2012-02-23 17:48:30 |
Profil
Beitrag #4 • | >4.was bedeutet eine Expression des Gens?
Die Expression eines Gens ist die Produktion des codierten Proteins.
Wenn also das Gen abgelesen wird und über
- die Ablesung ->mRNA
- die Prozession (Herausschneiden von Introns)
- die Translation an den Ribosomen
letztendlich das Protein hergestellt wird (oder exprimiert)
dann nennt man das auch die Expression des Gens | | acribio | 2012-02-23 18:33:06 |
Profil
Beitrag #5 • | >zu 5.)
http://www.scienceblogs.de/bloodnacid/2011/06/forensische-genetik-multiplexstrpcr-und-kapillarelektrophorese.php | | bibabuu | 2012-02-24 11:58:19 |
Profil
Beitrag #6 • | Die Bande der DNA bei 20.000 bp ist einfach die genomische DNA die aufgetragen wurde also kein PCR Produkt wie vermutet sondern die isolierte DNA. Durch die PCR auf GAPDH wurde ja die mRNA in cDNA umgeschrieben und ist auch 450 bp lang hab das vll echt schlecht formuliert. Zu 5.) die Seite hatte ich schon gefunden :)
Vielen Dank für eure Hilfe! | | Beiträge 1 bis 6 von 6 angezeigt. |
|
|
