Fragen für Experte-Hilfe Erbeten |
| Daniela | 2011-12-22 00:53:45 |
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Beitrag #1 • | Hallo Liebes Team.
Ich habe einige fragen, die mich schlaflose Nächte gekostet haben:
1.
Spezielle Probleme der heterologen Expression in den einzelnen Ebenen (Transkription,
Transkript-Prozessierung,Translation, Post-translationale Modifikationen)
2. Wir wird eine Proteinkinase identifiziert? (Mit welcher Methode, auch die Methode müssen wir kurz beschreiben)
2b wie werden phosphorylierte Proteine identifiziert?
3. Wie wird überprüft, ob eine Insert-DNA (ein Gen) in dem wirtsorganismus ist (aufgenommen wurde )?
Wie wird überprüft, ob dieses Gen in ein Produkt (messenger RNA) transkribiert wird?
Wie wird überprüft, ob aus dieser mRNA ein Protein gebildet wird (translatiert wird) und schliesslich ob das Protein funktionell ist?
(Stets wollte mein "Boss" passende Methoden zu jeweiliger Ebene wissen und kurze Beschreibung,warum die Identifikation mit dieser Methode klappt ?
Ich hoffe, es finden sich hier einige experten,die das wissen denn mein Prof ist wirklich unbarmherzig (ohne zu übertreiben....).... | | acribio | 2012-01-12 20:57:49 |
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Beitrag #2 • | Hallo Daniela,
zuerst zu Frage 3: (Alle Antworten ohne Garantie)
Wie wird überprüft, ob eine Insert-DNA (ein Gen) in dem wirtsorganismus ist (aufgenommen wurde )?
Genomische DNA isolieren und eine Hybridisierung mit einer radioaktiven Gen-Sonde oder sonstwie markierten Sonde durchführen. Es ginge natürlich auch eine PCR mit genomischer DNA und Primern zum Genstück.
Wie wird überprüft, ob dieses Gen in ein Produkt (messenger RNA) transkribiert wird?
mRNA isolieren und eine cDNA mittels Reverser Transcriptase schreiben, anschließend eine PCR (RT-PCR)
Wie wird überprüft, ob aus dieser mRNA ein Protein gebildet wird (translatiert wird) ?
Dazu fällt mir nur ein Western-Blot ein, also ein Nachweis mit einem Antikörper zum spezifischen Produkt.
Und schließlich ob das Protein funktionell ist?
Wenn es ein Enzym mit einer Funktion ist, dann muss man wohl diese nachweisen. Wenn es ein Bindeprotein ist, dann muss man die Bindung nachweisen können Far-Western, ELISA / Phosphorylierungs-Studien (ich meine nur intakte Proteine werden phosphoryliert),
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