PCR mit Poly T Primer |
| Thurman | 2011-07-14 08:36:14 |
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Beitrag #1 • | Sehr geehrte Community,
mir steht in kürze ein Experiment bevor, bei dem ich auf etwas Erfahrung zurückgreifen möchte. Ich möchte das Ende eines Gens amplifizieren und habe dazu einen Poly T Primer und einen genspezifischen Primer konstruiert. Aufgrund des Poly T Charakters ist der Schmelzpunkt natürlich recht bescheiden und korreliert nicht unbedingt sehr mit dem des genspezifischen Primers. Wenn ich allerdings die Primerlänge des genspez. Primer herabsetze um die Schmelztemp. anzupassen, werden sicherlich die auftretenden, unspezifischen Bindungen mir die Auswertung zur Hölle machen.
Hat jemand da bereits Erfahrung gesammelt?
Vielleicht ein Kniff bei der Salzkonzentration etc.?
Über fundierte Hilfe würde ich mich sehrst freuen!
Vielen Dank an dieser Stelle,
T. | | acribio | 2011-07-18 10:40:57 |
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Beitrag #2 • | Hallo Thurman, willkommen im Forum!
>Wenn ich allerdings die Primerlänge des genspez. Primer herabsetze
besser nicht. Eben dies würde die Unspezifität erhöhen.
Über die Schmelzpunkte sollte man sich nicht soo den Kopf zerbrechen.
Er muss bloß ausreichend hoch sein, das ist entscheidend. Ich kann auch einen Primer mit 98°C Schmelztemperatur bei 45°C sehr gut annealen! und auch einen mit 60° oder 50°C. Die Anpassung der Annealing-Temperatur an den Schmelzpunkt ist nicht hilfreich. Wenn ich weit unter den Tm gehe mit der Annealing-Temperatur, dann bindet der Primer auch nicht irgendwo, sofern er lang genug ist! Wie sähe diese Betrachtung wohl aus bei einem Primer mit 100bp? etwa 82°C Annealing-Temperatur?
Man sollte einfach immer mindestens 23-25 bp als Primer nehmen, dann ist auch die Basenzusammensetzung nicht relevant, d. h. selbst wenn nur As und Ts in der Sequenz sind, ist der Schmelzpunkt ausreichend hoch.
Die Annealingtemperatur kann man durchaus 10 und mehr Grad UNTER der Schmelztemperatur wählen. (Erinnerung Schmelzpunkt heisst, 50%binden 50% binden nicht! Viele setzen die annealing-Temp etwa auf die Tm, und vergessen dabei, dass dann der Primer nicht mal vollständig gebunden hat!
Was hilft nun die dadurch eventuell auftretenden Fehlbindungen zu minimieren?
Hot-Start! D. h. die Polymerase erst zugeben, wenn alles mind. 1-2 min. denaturiert ist.
Und: Die Annealing und Extension time genauer im Auge behalten und an die Polymerase anpassen, also nicht bloß einfach 1min wie seit Jahr und Tag.
Denn in 1min ist nicht nur der Primer annealed (das dauert so ca. 2-7 sek.!!), sondern die taq-Polymerase schafft in 1min annähernd 1200bp! (= 20 bp/sek x 60 sek)
Mit ein bisschen Pech ist die Polymerase dann schon bei dem, wass man Annealing-Temperatur nennt, ein 300bp Fragment 4x durch. Dadurch kann man überhaupt keine Aussagen mehr treffen.
oligo-dT-Primer kann man auch mit einer Wobbelbase am Ende (also ein mix aus AGC) herstellen lassen und dann etwas mehr davon in die PCR geben. Mit dem dass der poly-A-Schwanz nicht so endlos mit amplifiziert wird, denn der kann ganz schön lang sein und somit die Produkte sehr unterschiedlich lang.
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