Problem mit der Transformation von E.coli JM109 mit einem rekombinanten pUC18-Plasmid |
| Meini | 2011-03-18 17:11:20 |
Profil
Beitrag #1 • | Hey,
ich habe ein Problem mit der Transformation von E.coli JM109 mit einem rekombinanten pUC18-Plasmid, Insertlänge von 1400 bp. Insert und Plasmid wurde mit BamHI und HindIII hydrolysiert, das Plasmid desweitern mit CIAP dephosphoryliert. Nach Ligation durch T4-Ligase erfolgte die Transformation mittels Heat-Shock. Nun zum eigentlichen Problem: Dieser Versuch mit anschließender Blau-Weiss-Selektion hat mit frisch angesetzen kompetenten Zellen nach Hanahan bestens geklappt, jetzt habe ich kompetente Zellen zum Einfrieren nach Inoue hergestellt und bekomme keinerlei rekombinante Klone. Die Kompetenz der Zellen nach Inoue wurde mit unverändertem pUC18 getestet und Transformationsraten von 10^8 - 10^9 pro µg DNA erreicht. Auch die Aktivität der Enzyme wurde überprüft. Kann es sein das Zellen nach Inoue das rekombinante Plasmid nicht aufnehmen können?
Danke! | | acribio | 2011-03-21 22:01:48 |
Profil
Beitrag #2 • | Hallo Meini,
hm
meinste Du damit, dass die Testtransformation mit einem beliebigen fertigen Plasmid jede Menge blauer Klone ergeben hat, oder hattest Du mit dem Ligationsansatz blaue UND weisse Klone?
| ... keinerlei rekombinante Klone |
|
Ich denke, dass die Aufgabe (1400bp Insert / nebst zwei Restriktionsschnittstellen) schon sehr haarig sein kann, an soetwas bin
ich auch schon mal verzweifelt. Große Probleme machen meiner Meinung nach Inserts die länger sind, sprich >1kb
und dann noch zwei Enzymverdaus... und dann auch noch CIAP...
Nebenbei: Kann man nicht die Dephosphorylierung weglassen, wenn
man mit zwei verschiedenen Schnittstellen arbeitet? (Soll doch nur verhindern, dass der Vektor, ohne Insert religiert; kann das bei Bam/Hind passieren?
Ich bin am Ende auf einen Weg mit einer Restriktionsschnittstelle ausgewichen, auch PCR-Klonierung hilft manchmal, Primer kann man ja heutzutage bis 120bp machen lassen. Auch blunt-end ist ein Versuch wert. Man sollte es nicht glauben, aber so eine sticky-end Klonierung ist meiner Meinung nach nur in Büchern und in der Theorie effektiver, klappen tuts nie.
Ich kenne die angesprochenen Transformationsmethoden Inoue und Hanahan nicht. Ich habe sie mir gerade einmal durchgelesen.
Eins kann ich jedoch sagen, Unterschiede bei frisch angesetzten und eingefrorenen kompetenten Zellen gibt es. Dahingehend, dass die eingefrorenen deutlich schlechter sein können.
Auch wenn Deine Transformationsraten sehr gut aussehen, muss man bedenken, dass das ligierte Plasmid bei weitem größer und aufgedröselter ist und so natürlich sehr schlecht in die Zelle einwandert.
während das Testplasmid natürlich schön kompakt ist.
Die Größe des Inserts, nebst zwei verschiedenen Schnittstellen bewirkt zusätzlich, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Enden sich finden stark sinkt. Also viel hilft hier viel. Viel Insert und viel Plasmid, und ausreichend Ligase. Mit sticky ends kann man das auch machen. Mit Blunt ends auch, wenn man den Vektor geCIAPt hat. Die Konzentrationsberechnungen Vektor /Ligase sind ein bisschen graue Theorie, aber jeder hat da so seine eigenen Vorstellungen.
Im Prinzip ist "keinerlei rekombinante Klone" das häufigste Ergebnis, leider
| | Beiträge 1 bis 2 von 2 angezeigt. |
|
|
