mRNA isolierung |
| eka021 | 2010-07-28 11:18:34 |
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Beitrag #1 • | Hallo,
ich hätte eine frage, ich isoliere ein protein aus pflanzen und möchte jetzt rekombinant arbeiten. da ich aber keine sequenzen kenne muss ich über die mRNA gehen, gibt es noch weitere möglichkeiten?
Wenn ich über die mRNA isolierung gehe und diese dann mit Oligo-TTT Primern einer PCR unterziehen, dann erhalte ich ja alle mRNAs die in der Pflanze vorhanden sind - wie kann ich jetzt meine spezifische mRNA finden??
Wäre dankebar für eine Antwort.
lg eka | | acribio | 2010-07-29 14:14:57 |
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Beitrag #2 • | Hallo eka,
| dann erhalte ich ja alle mRNAs die in der Pflanze vorhanden sind |
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ja das ist richtig. Wenn Du allerdings einen Primer deines Gens nimmst, dann hast du gleich dein gewünschtes Konstrukt.
Wenn du mRNA isolierst, dann kannst du eine Genbank erstellen. Das ist aber keine Kleinigkeit, die nebenbei geht.
In dieser Genbank, die dann alle mRNAs bzw. cDNAs deiner Pflanze enthält, sind die Genstücke z. B. in lambda-DNA oder sonstwie in einem Vektor eingebaut.
cDNA-Genbank-Screening:
Das Verfahren, welches sich anschließt heisst Screening. Du musst dann diese Vektoren in Bakterien schleusen und ausplattieren, d.h. vereinzeln. bis du Einzelkolonien hast, und in einem dieser Bakterien wäre dann auch Dein Gen. Dieses musst du selektieren (screenen). Das geht z. B. mit Filterabzügen der Agar-Platten und radioaktiven, oder DIG Sonden, die dann mit der DNA auf den Filterabzügen hybridisieren muss, oder mittels PCR(-Screening).
| | eka021 | 2010-08-02 11:41:06 |
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Beitrag #3 • | Hallo,
erstmal danke für die Antwort. Allerdings hab ich dazu noch ein paar fragen.
wenn ich mich auf eine konservierte für das protein typische stelle setze erhalte ich ja nur einen teil der sequenz,oder ? oder aber mache ich dann ausgehend von dieser eine 5' und 3' primer und sollte so dannmein gesamtes protein erhalten?
ad: In dieser Genbank, die dann alle mRNAs bzw. cDNAs deiner Pflanze enthält, sind die Genstücke z. B. in lambda-DNA oder sonstwie in einem Vektor eingebaut.
ich kann mir dann die genstücke ligieren und in e.coli geben, kann man dort dann nicht noch mit der blau weiß selektion arbeiten? oder verwechsel ich da etwas?
danke
lg
| | acribio | 2010-08-03 10:42:27 |
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Beitrag #4 • | | In dieser Genbank, die dann alle mRNAs bzw. cDNAs deiner Pflanze enthält, sind die Genstücke z. B. in lambda-DNA oder sonstwie in einem Vektor eingebaut. |
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In aller Regel JA.
| ich kann mir dann die genstücke ligieren und in e.coli geben, kann man dort dann nicht noch mit der blau weiß selektion arbeiten? oder verwechsel ich da etwas? |
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Ja so in etwa...
wenn ich mich auf eine konservierte für das protein typische stelle setze erhalte ich ja nur einen teil der sequenz,oder ? oder aber mache ich dann ausgehend von dieser eine 5' und 3' primer und sollte so dannmein gesamtes protein erhalten?
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Die Fragen können kaum beantwortet werden, da reichlich durcheinandergewirbelt ist.
Vielleicht zielt Deine Frage auf eine 5'RACE PCR? keine Ahnung
| wenn ich mich auf eine konservierte für das protein typische stelle setze |
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Ganz abgesehen davon, dass Proteine nicht als Sitzplätze geeignet sind... :D meinst du mit "setzen" vielleicht eine Sonde zur Hybridisierung, oder vielleicht eine RT-PCR, mit Primern, die aus der Aminosäuresequenz einer relativ konservierten Stelle des Proteins ableiten lassen? Ist etwas unklar. Einige der angedachten Prozeduren sind erheblich schwieriger und umfangreicher, als Du vermutlich denkst, wenn man deine Gedanken versucht nachzuvollziehen. | | eka021 | 2010-08-03 15:55:30 |
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Beitrag #5 • | Hallo
es tut mir leid, dass ich so verwirrt schreibe, aber ich bin mir eben auch nicht so recht schlüssig und habe keinen ansprechpartner
vielleicht ist es ein wenig strukturierter:
ich kenne die sequenz (aminosre) von einem anderen organismus. da es sich um ein metalloprotein handelt gibt es bindungsstellen, die charakteristisch sind für dieses protein.
meine frage ist zum einen, wenn ich diese region wähle für einen primer (der sowohl in 3' als auch in 5' richtung arbeiten soll) ob ich dann so meine gesamte sequenz erhalte für die cDNA. und ja ich meine 5'RACE PCR, nur kenn ich mich nicht sehr gut aus damit.
die andere frage ist die detektion der cDNA, es ist mir leider noch immer nicht klar, wie ich meine cDNA bestimmen kann.
und es ist denk ich wirklich nicht so einfach, leider kein normales praktikumsbeispiel
aber danke für deine bemühungen
lg | | acribio | 2010-08-05 11:04:22 |
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Beitrag #6 • | In meinem Arbeitskreis wurden einmal so ähnliche Fragestellungen behandelt.
Von der konservierten Region wurden zuerst einmal Primer abgeleitet, die an jeder dritten Stelle des Basentripplets einen Mix an mehreren Basen hatten, die sogenannte Wobbelbase.
Solche Primer kann man kaufen. Damit kann man versuchen mittels RT-PCR und der mRNA des neuen Organismus Banden zu erhalten. Wenn das klappt, kann man versuchen diese Banden zu klonieren. Damit hätte man dann schon mal ein kleines Stück der neuen Sequenz, von der man dann z. B. Sonden (radioaktiv oder wie auch immer) herzustellen könnte, die zur Hybridisierung eingesetzt werden können. Northern Blots wären damit möglich. Ebenso könnte man damit das oben beschriebene Screening-Verfahren durchführen und so ein größeres Stück, vielleicht sogar das ganze Stück ergattern.
Die 5'-Race-RT-PCR ist ein Versuch "obenliegende" also 5' liegende Sequenzen ohne Klonierung und ohne cDNA Bank zu erhalten. Das ist sicher auch nix für Anfänger. Wie alle diese Verfahren.
Heutzutage würde man wohl versuchen, sich die technischen Errungenschaften bei der Primerherstellung und bei der Sequenzierung (und Gen-Datenbanken!!) zunutze zu machen.
Vielleicht ließe sich die Sequenz eines RT-PCR Produkts Deiner konservierten Region durch PCR-Sequenzierung bereits ermitteln?
Man kann heute bereits Primer mit 120bp Länge herstellen, die können sogar markiert werden und als Gen-Sonden eingesetzt werden.
Wenn die Organismen aber bereits in Datenbanken vorhanden wäre, könnte man sich die Sequenzen dort holen, nicht vergessen(tblastx)!!
Aber die Sequenzen sind vermutlich nicht in Gen-Datenbanken zu finden...?
Ganz egal ob am Ende eine Klonierung oder eine 5'Race-PCR steht, auf jeden Fall wäre es ein normaler Anfang einmal mittels RT-PCR die konservierte Region zu amplifizieren und Banden zu erhalten. Hierfür könnte man diese "wobbelbasen"-Primer nehmen, man könnte es aber auch einmal mit den Primern aus dem bekannten Organismus, die man schon hat versuchen. (Die Vorteile von den Wobbelprimern finde ich fraglich). Wenn man da Banden erhält, dann kann man an Sequenzierung denken und an 5'Race und an Klonierung...
| | Nibbler | 2010-08-22 00:17:50 |
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Beitrag #7 • | Ich würde RNA isolieren (TRIZOL), dann eine 5´ und 3´-RACE Bank anlegen.
Degenerierte forward Primer (zwei, welche nicht überlappen) für die konservierte Region bestellen. Dann mit dem Primer (näher am 5´ Ende) und dem RACE-Primer auf die 3´Bank eine touchdown PCR machen. Auf das PCR Produkt eine zweite PCR mit dem anderen Primer (nested PCR). Die Produkte klonieren un sequenzieren.
Mit Hilfe der Sequenzen des 3´ Bereichs einen rev Primer bestellen, dann PCR mit rev und RACE Primer auf 5´ Bank. Wieder klonieren, Sequenzieren und schon hast du deine Sequenz inkl UTRs. | | Beiträge 1 bis 7 von 7 angezeigt. |
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