stabile Transfektion |
| Nicki | 2010-07-09 21:23:14 |
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Beitrag #1 • | Hallo,
Wenn eine Zelle stabil transfeziert wurde und mein Protein von Interesse beispielsweise mit GFP markiert ist, so kommt es doch nach einigen Zellteilungen vor, dass GFP nicht mehr nachgewiesen werden kann (im Mikroskop...). Ist dies nur der Fall, wenn das Plasmid verloren gegangen ist (bsp durch zu wenig Selektionsdruck)? Oder ist es möglich, dass mein gewünschtes Protein trotzdem noch expremiert wird, aber GFP nicht mehr fluoresziert?
| | acribio | 2010-07-18 22:04:52 |
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Beitrag #2 • | vieles ist möglich...
Ich würde sagen das Erstere ist das Wahrscheinlichste.
Das Letztere würde ich auch nicht ausschließen, aber ich würde es für unwahrscheinlich halten.
Genauer:| Ist dies nur der Fall, wenn das Plasmid verloren gegangen ist |
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Ein Plasmid verliert sich, dünnt sich aus in der Zellkultur. Es kann aber auch ins Genom einbaut werden, dann ist die Zelle stabil transfiziert.
| Oder ist es möglich, dass mein gewünschtes Protein trotzdem noch expremiert wird, aber GFP nicht mehr fluoresziert |
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Das halte ich für recht unwahrscheinlich, aber dein Proteinkonstrukt kann natürlich auch kaputt gehen... insbesondere beim Einbau ins Genom.
| | acribio | 2010-07-18 22:22:58 |
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Beitrag #3 • | Oh - Ich hatte wohl überlesen, dass deine Zellen ja bereits stabil transfiziert SIND!
Dass die Zellen den eingebauten Vektor trotzdem wieder verlieren, kann einige Gründe haben ( bin kein Zellkulturexperte!!). Vielleicht hängt es mit dem Gen zusammen welches durch den Einbau des Vektors ins Genom zerstört wurde. Deshalb muss man wohl mehrere stabil transfizierte Zelllinien vergleichen und schauen, wie stabil sie wirklich sind. Auch das nur das GFP "abgestoßen" wird, soll auch schon vorgekommen sein, schließlich stammt es ja aus einem ganz anderen Organismus. Eine Kontrolle mit einem Antikörper gegen dein Protein hilft vielleicht weiter.
| | Nicki | 2010-07-20 03:09:33 |
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Beitrag #4 • | Danke für die Antwort!
"Eine Kontrolle mit einem Antikörper gegen dein Protein hilft vielleicht weiter."
Genau das habe ich mir auch gedacht. Aber bevor ich diesen Antikörper (gegen GFP) bestelle, wollte ich sicherstellen, dass das rein theoretisch auch Sinn macht. | | Beiträge 1 bis 4 von 4 angezeigt. |
