cDNA-Suche bei gegebenem Protein |
| fa | 2010-05-20 10:57:13 |
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Beitrag #1 • | Hi!
Vielleicht mag die Frage leicht euch leicht erscheinen, aber ich bekomme einfach kein einfache Lösung zusammen:
"Ein B-Lymphozyt produziert einen Antikörper, dessen DNA-Sequenz nicht bekannt ist. Ihre Aufgabe ist es, am Ende des Tages einen Plasmid in Ihrem Tube zu haben, der die cDNA dieses AK enthält. Wie gehen Sie vor?"
Kann mir jemand helfen?
Danke schonmal! | | acribio | 2010-05-20 14:48:59 |
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Beitrag #2 • | Hallo fa,
es muss heissen "am Ende DES JAHRES..."
also:
"Ihre Aufgabe ist es, am Ende des JAHRES einen Plasmid in Ihrem Tube zu haben, der die cDNA dieses AK enthält. Wie gehen Sie vor?" | | acribio | 2010-05-20 17:34:24 |
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Beitrag #3 • | Ich versuche ernst zu bleiben, die Frage erinnert mich trotzdem ein bisschen an folgende
Physikprüfung von Niels Bohr
später mehr | | acribio | 2010-05-20 18:23:28 |
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Beitrag #4 • | Ich finde die Frage ist nicht gerade leicht und birgt mehrere Missverständnisse. Ich versuche einmal alle möglichen Unklarheiten und weniger sinnvollen Lösungsideen beiseite zu lassen und mit dem sinnvollsten Lösungsansatz zu beginnen:
Vermutlich steht der Antikörper bzw. die produzierenden Lyphozyten bereits in kultivierter Form zur Verfügung, so dass der Antikörper isoliert und für Färbereaktionen eingesetzt werden kann?
Der Antikörper müsste sein Antigen markieren, eine passende Färbemethode, also ein Zweitantikörper mit Farbreagenz o.ä. sei ebenfalls vorausgesetzt.
Zu tun bleibt dann "nur noch" ein Screening von einer Genbank, die das Genom, besser noch die Gesamtheit aller cDNA's der Antikörper des Organismusses enthält, und zwar gleich in expressionsfähiger Form.
Diese Genbank müsste man dann
- kultivieren und auf Agar-Platten ausplattieren
- zur Expression induzieren (IPTG),
- Filterabzüge von den Platten herstellen,
- damit dann z.B. Replikate der Agarplatten herstellen
- die Proteine auf den Filtern fixieren,
- die Filter mit dem Antikörper inkubieren und so
- den gewünschten cDNA Klon selektieren. | | acribio | 2010-05-21 11:18:45 |
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Beitrag #5 • | Oops!
Ist natürlich auch Quatsch. Das Epitop, welches der Antikörper bindet, ist ja gar nicht das Protein, welches der oben selektionierte cDNA Klon exprimiert.
Also ehrlich gesagt finde ich auch keine einfache Lösung!
Proteinsequenzierung ? Das war wohl nicht gefragt, oder?
| | acribio | 2010-05-23 15:19:25 |
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Beitrag #6 • | Eine Idee:
Die Zelle enthält den Antikörper stark überexprimiert und damit sollte auch die mRNA des Antikörpers überproportional häufig vorkommen.
Man müsste die RNA bzw. mRNA der Zellen (oder der einer entsprechenden Zelllinie) isolieren, daraus cDNA herstellen und diese klonieren. Dann muss man einen Klon mit der cDNA des Antikörpers selektieren.
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