RNA-Extraktion aus Boden |
| Arnica | 2009-07-08 17:18:08 |
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Beitrag #1 • | Ich suche jemanden, der Erfahrung mit der RNA Extraktion aus Boden hat, am besten mit dem RNA PowerSoil Kit von MoBio, das ich verwende.
Ich habe zig Proben problemlos damit extrahiert, seitdem funktioniert etwas plötzlich nicht mehr, und ich finde nicht raus, was. Mein Verdacht ist, dass es mit dem Phenol:Chlorophorm:IAA zusammen hängt, jedenfalls bekomme ich nach der Ausfällung mit Isopropanol nichts. | | acribio | 2009-07-13 09:29:05 |
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Beitrag #2 • | Hallo Arnica,
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol hat m.E. das Problem, dass die Verluste sehr hoch sind. Mein Bauchgefühl sagt mir, dass bei RNA Extraktion aus Boden (!) sehr wenig RNA anfällt und dass es leicht dazu kommen kann, dass die ganze RNA futsch ist.
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohl muss denke ich auch relativ frisch sein und gut gelagert. Würde ich noch mal frisch besorgen, wenns im Kit ist, dann diesen auch frisch besorgen.
Auch die Fällung mit Isoamylalkohol ist verlustanfälliger als die Fällung mit Ethanol denke ich.
Alle Methoden funktionieren nur am Anfang gut (ist sicher ein Gesetzt von Murphy)
| | Arnica | 2009-07-14 17:24:09 |
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Beitrag #3 • | Das Phenol ist kein Teil vom Kit, und ich habe es neu gekauft, nachdem das Problem auftauchte. Es sollte also nicht der Grund sein. Das seltsame an der Sache ist, dass die wässrige (?) Lösung nach dem Abzentrifugieren noch mal mit einer unbekannten Lösung gemischt wird, die dann noch Verunreinigungen ausfällt. Diese Lösung wird dann mit Isopropanol ausgefällt, was normalerweise in einem grossen Pellet resultiert. plötzlich mischen sich beide Lösungen aber nicht mehr, sondern bilden eine Emulsion, die beim Zentrifugieren wieder getrennt wird, Isopropanol oben und die Lösung mit den Nukleinsäuren (?) unten. | | acribio | 2009-07-15 19:37:52 |
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Beitrag #4 • | Hallo Arnica,
Phenol gekauft? Das müssen wir jetzt erstmal ausdiskutieren :-)
Du hast doch hoffentlich nicht "einfach Phenol gekauft" ?
Bitte schau dir einmal folgende Produkte an und lies bitte auch die Zusätze unter den Beschreibungen
Redestilliertes, in Wasser gesättigtes Phenol, pH 4,5-5 zur RNA-Extraktion
Roti®-Aqua-Phenol eignet sich optimal zur RNA-Isolierung und für andere Verfahren, bei denen ein niedriger pH-Wert des Phenols gewünscht wird. Durch den niedrigen pH-Wert sammelt sich die DNA eher in der Interphase an, sodass die DNA-Kontamination im RNA-Eluat vermindert wird.
Redestilliertes, in TE-Puffer äquilibriertes Phenol, pH 7,5-8,0 zur Nukleinsäure-Extraktion
Für die Nukleinsäure-Isolierung verwendetes Phenol muss vor Gebrauch mit Puffer abgesättigt und der pH-Wert muss eingestellt werden. Roti®-Phenol ist redestilliertes, in TE-Puffer äquilibriertes ready-to-use-Phenol.
Das Phenol muss auf jeden Fall equilibriert sein und es gibt
für Nukleinsäuren zwei verschiedene pH-Werte zu denen äquilibriert wird.
Schau dir am besten alle der Produkte in dieser Kategorie an.
| | Arnica | 2009-07-16 12:24:54 |
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Beitrag #5 • | Was ich gekauft habe, ist Phenol:Chlorophorm:IAA, pH zum Einstellen, zur Extraktion von Nukleinsäuren. Das kann auch nicht das Problem sein, es hat damit ja schon mal funktioniert. | | acribio | 2009-07-16 13:57:13 |
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Beitrag #6 • | aha - okay
>Das kann auch nicht das Problem sein, es hat damit ja schon mal funktioniert.
Na das wird vermutlich stimmen, obwohl die Beschreibung bei dem Produkt mit pH 4 -4.5 scheint mir eher zu passen.
>Das seltsame an der Sache ist, dass die wässrige (?) Lösung nach dem Abzentrifugieren noch mal mit einer unbekannten Lösung gemischt wird, die dann noch Verunreinigungen ausfällt.
Das scheint mir eine Reinigungsprozedur zu sein, bei der Polysaccharide abgetrennt werden. Hierfür habe ich z. B. von einer anderen Firma folgendes Produkt verwendet. Dies wird (optional) nach der letzten Fällung eingesetzt, wie bei dir. Das sollte man dann einsetzen, wenn die UV-260/280 ratio weit entfernt von den normalen 1.6 - 2 ist (oder bei
niedrigen Ausbeuten...)
opti-pure
Sehr empfehlenswert sind auch die Beschreibungen der RNA-Isolierungs-Produkte dieser Firma. Also schau dir auch mal die Manuals zu diesen Produkten an.
Ansonsten hab ich irgendwie keine Ideen mehr zu deinem Problem,
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