Klonierung von Bacillus Thuringiensis Protein in Mais - Gentechnik Methoden |
| Dora | 2009-06-04 15:02:08 |
Profil
Beitrag #1 • | Hallo!
Bitte nicht wundern, mein Beitrag ist wohl auf einem etwas anderem Leistungsniveau. Ich muss für mein mündliches Abitur über Bt-Mais recherchieren, doch kann mir die gentechnischen Vorgänge nur schwer vorstellen. Um genauere Informationen zu bekommen, dachte ich, ich trau mich mal hier Spezialisten zu fragen ;-) Also Entschuldigung für meine für euch wohl dummen Fragen, ich freue mich über jede Hilfe.
Ich denke das theoretische Prinzip habe ich schon verstanden. Ich kann mir nur die praktischen Verfahrenstechniken nicht so recht vorstellen.
Zunächst muss man im bacillus thuringiensis ja das Gen entnehmen, das für die Produktion von Bt-Toxin verantwortlich ist.
Wie findet man das richtige Gen?
Wie entnimmt man das Gen?
Wie schafft man es, dass das Gen sich in die DNA des Vektors einbaut?
Wie wird das transgene Agrobakterium in die Pflanzenzelle eingeschleust?
Vielen Dank im Voraus.
| | acribio | 2009-06-05 11:11:24 |
Profil
Beitrag #2 • | Hallo,
werde mich deiner Fragen heute abend widmen ;)
Du hast recht, das ist ein anderes Leistungsniveau, solche Fragen werden hier eigentlich nicht beantwortet. :D (kleiner Scherz)
| | Dora | 2009-06-05 21:19:33 |
Profil
Beitrag #3 • | Vielen Dank, bin schon gespannt :-) | | acribio | 2009-06-08 22:51:56 |
Profil
Beitrag #4 • | Hallo Dora,
also deine Fragen umfassen fast die gesamte Biochemie, von jüngster Forschung bis zu älteren, bereits
lange bekannten Techniken. Ganz bin ich nicht in der Pflanzengenetik zu Hause,
deshalb keine Garantie für meine Aussagen.
Ein paar Links zum Einstieg:
http://de.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis
http://www.biosicherheit.de/de/lexikon/39.bacillus_thuringiensis_bt.html
http://www.biosicherheit.de/de/lexikon/43.bt_protein_toxin.html
Dröseln wir von hinten auf:
>Wie wird das transgene Agrobakterium in die Pflanzenzelle eingeschleust?
zuerstmal wird vermutlich nicht das gesamte Bakterium, sondern nur ein Plasmid mit
dem codierten bt-Protein in die Pflanzenzelle (Mais) überführt. Das Agrobakterium dient nur
Als Wirt.
Ein bisschen muss man zwischen Eukaryonten und Prokaryonten unterscheiden. Prokaryonten
(z. B. Bakterien) haben keinen Zellkern und sind einfacher als Eukaryonten (Pflanze/Menschen u. Tier)
Beide können heutzutage mit fremden Genen versehen werden. Durch Transfektion bei
Eukaryonten bzw. durch Transformation entstehen
transgene Organismen.
Die Prozesse sind natürlich bei Bakterien etwas einfacher, als bei Eukaryonten, wie z. B. Mais oder Mensch.
Beide beginnen damit, dass die fremde zumeist ringförmige DNA (teilweise auch RNA)
durch die Zellwand kommt. Das passiert im Labor
- durch chemische Substanzen, die die Zellwand porös
machen, oder durch
- Proteinkomplexe, die das Einschleusen von DNA/RNA bewirken (diese Techniken sind
von Viren perfektioniert worden), oder auch durch
- hohe elektrische Spannungen (diese reißen Löcher in die Zellwand). Jetzt ist das Plasmid im Bakterium und die codierten Proteine können schon
produziert werden. Das kann in einem Bakterienstamm schon reichen, die Plasmide werden auch
bei der Zellteilung weitergegeben, sie haben meist Sequenzen, die die eigene Vervielfältigung
im Bakterium bewirken und die Plasmide vervielfältigen sich unabhängig vom Bakteriengenom.
Bei Eukaryonten führt das noch nicht sehr weit. Oft sind die zuerst produzierten
Proteine dazu gedacht die EIGENTLICHE Sequenz in den Zellkern und ins Genom (also in die Chromosomen)
zu bringen, oder sonstwie die normalen Abläufe in der Wirtszelle auszutricksen.
Wie kommt jetzt das Gen auf die Chromosomen (im Eukaryonten) oder im Bakterium (Prokaryont)
in das Bakteriengenom? Bei Bakterien passiert dies z. B. spontan.
Die Bakterien können untereinander DNA austauschen z.B. Resistenzgene gegen Antibiotika,
Oder bei Anwesenheit von speziellen Proteinen von Viren, denn die Viren haben sich das
schon perfekt ausgedacht, die Bakterien zu infizieren.
Bei Eukaryonten sind die Viren ebenfalls die Vorbilder. Mit Hilfe spezielle Sequenzen,
sogenannte http://de.wikipedia.org/wiki/Transposons
welche homologe Sequenzen zum Zellgenom haben und über diesen Weg mit einer
gewissen Wahrscheinlichkeit ins Genom importiert werden (Das ist EIN Weg). Wenn also z. B.
eine Zelle auf den Lippen mit Herpes Simplex viren
infiziert wird, dann geht das Virusgenom zuerst in die Wirtszelle, und wird
dann zu einer gewissen Wahrscheinlichkeit ins Genom übernommen. Alle Proteine, die
nötig sind, um z. B. viele neue Viren zu erzeugen sind auf dem Virusgenom vorhanden.
Oft wird dann in Stresssituationen das Virus aktiv und fängt an den Wirt auf die Massenproduktion
der eigenen Viren umzuschalten. Solche Viren können z. B. Tumore oder Warzen verursachen. Jede Zelle eines Mensch hat
im Genom zahlreiche solche Tumorviren im Genom, gegen die wiederum Abwehrmechanismen aufgebaut
werden mussten, z. B. sogenannte Tumorsuppressorgene. Ein Grippevirus baut sich hingegen nicht
ins Genom ein.
Kommen wir nun zu den Techniken, die bereits längerer Zeit bekannt sind:
>Zunächst muss man im bacillus thuringiensis ja das Gen entnehmen, das für die Produktion von Bt-Toxin verantwortlich ist.
Wie findet man das richtige Gen?
Wie entnimmt man das Gen?
Wie schafft man es, dass das Gen sich in die DNA des Vektors einbaut?
Solche Bakterien zu charakterisieren und zu kultivieren ist natürlich die Voraussetzung, dass man
überhaupt damit arbeiten kann. Wie findet man jetzt das Gen:
Früher hat man z. B. durch ungerichtete Mutationen (chemisch oder durch Radioaktivität) ungerichtet Mutationen (Basenaustausch oder auch
Deletionen)
auf dem Genom erzeugt und diese dann charakterisiert. Wenn man jetzt einen Bakterienstamm identifiziert, bei
dem das Bacillus thuringiensis-Protein wirkungslos ist, dann muss man "nur noch" die Mutation durch Sequenzierung finden.
So kann man das Gen identifizieren. Dieses Verfahren kann man im Gen des Proteins fortsetzen und durch weitere
Mutationen z. B. das aktive Zentrum herausfinden.
Viele Mutationen zeigen gar keine Wirkung, das aktiven Zentrum des Proteins ist dagegen sensibler.
Man macht dies heute gerichteter, mittels Primern und der PCR lassen sich nahezu beliebige Sequenzen erzeugen
und in Plasmide(=Vektoren) einbauen.
Wie entnimmt man das Gen?
Wie schafft man es, dass das Gen sich in die DNA des Vektors einbaut?
Fremde zu untersuchende Proteine werden in der Gentechnik auf Plasmiden
in Bakterienstämmen "gehalten". D.H. der erste Schritt um ein Protein/Gen gentechnisch zu untersuchen ist es
dieses zu "klonieren". Die entsprechenden Sequenzen müssen sich am Ende auf einem Plasmid befinden, und
dieses in einem Bakterienstamm, den man einfrieren kann. Alle weiteren gentechnischen Schritte werden
mit dem Stamm gemacht (z. B. eine Vermehrung/Großproduktion des Plasmids um eine Veränderung des Gens vorzunehmen).
Am schwierigsten sind Gene aus einem Eukaryonten zu klonieren, da sehr viele Gene vorhanden
sind, das BT-Protein ist jedoch in einem Bakterium.
Man benötigt zum Klonieren eine sogenannte Genbank. Man stelle sich vor, dass man das Genom vom BT-Bakterium in
viele kleine Einzelstücke zerstückelt (z.B. mit einem DNA-schneidenen Enzym) und diese wahllosen Stücke in
ein Plasmid einbaut und dieses wiederum in (Labor-)Bakterien transformiert. Jedes Bakterium enthält jetzt nur noch einen Teil
der genetischen Information des BT-Bakteriums, aber zumeist noch ganze Gene (natürlich auch zerstückelte). Einer
dieser Bakterienstämme könnte nun das vollständige BT-Protein codiert enthalten und dieser muss identifiziert werden.
Sehr schlau, dass vorher auf dem Plasmid zum Klonieren auch Sequenzen zur Expression des Proteins (=Synthese des Proteins)
vorhanden waren. Diese Synthese wird dann chemisch aktiviert (z. B. durch Zugabe von modifizierten Zuckermolekülen).
Der Stamm mit dem BT-Gen, welcher hoffentlich auch das bt-Protein erzeugt (exprimiert) liesse sich so "leicht" identifizieren.
| | Dora | 2009-06-09 22:10:35 |
Profil
Beitrag #5 • | Hallo,
ich freue mich über die tolle und ausführliche Antwort. Danke, dass du dir Zeit genommen hast.
Das hat mir schon sehr weitergeholfen:-)
Also, wenn ich es richtig verstanden habe, muss man folgendes machen, um eine transgene Maiszelle zu erzeugen:
- Bt kultivieren
- DNA entnehmen
-> wie kann ich mir das vorstellen?
- früher wurde durch ungerichtete Mutationen die Sequenz des Bt-Toxin codierenden Gens herausgefunden, so dass man diese nur mit Hilfe der Genbank herausfinden muss
- Gen wird in Plasmid eingebaut, das in einem Bakterienstamm ist den man Einfrieren kann
-> in E. coli?
- zur Klonierung Primer und PCR
- nun wird die Zellwand mit chemischer Substanz porös gemacht, mit Proteinkomplex behandelt oder durch elektrische Spannung durchlöchert
-> Weißt du welche chemische Substanz, welches Protein? (weis nicht ob es zu kompliziert wird, ich frag nur aus Interesse)
- durch Transfektion, Transformation oder Transduktion gelangt Gen in Pflanzenzelle
- > wird bei allen Methoden mit dem Plasmid weitergearbeitet?
- durch Transposons wird Gen ins Genom eingebaut
- > das geschieht nicht auf künslichem Weg oder?
| | acribio | 2009-06-14 22:33:27 |
Profil
Beitrag #6 • | > in E. coli?
richtig. Die allermeisten Plasmide mit Genstücken sind vermutlich in e. Coli.
- Bt kultivieren
- DNA entnehmen
>wie kann ich mir das vorstellen
Nun, dass man das Bakterium kultivieren kann, das kannst du dir vermutlich vorstellen. Es gibt zahlreiche Medien die man so optimiert hat, dass die Bakterienstämme möglichst schnell wachsen und keinerlei Mangel leiden. Man züchtet die Bakterien z. B. in einen Liter Medium, welches man mit den Bakterien angeimpft hat und hat dann am nächsten Morgen eine dicke Suppe von Bakterien, die man abzentrifugiert. Je nachdem, was man isolieren möchte, muss jetzt die Vorschrift gewählt werden. Wenn ich die DNA der Bakterien haben möchte, dann muss ich die DNA isolieren. Dazu gibts Vorschriften, bei denen man z. B. die Zellwände und die Proteine denaturiert und/oder löst und nach mehreren Reinigungsschritten nur noch die DNA der Bakterien übrig bleibt. Diese kann man dann weiter verarbeiten (z. B. mit Enzymen in Fragmente spalten)
>weisst du welche Substanz
Ich habe dir prinzipiell zwei Wege genannt:
Einmal einen Weg mit den Proteinkomplexen, hierbei meinte ich eigentlich einen Weg, der von Viren "entwickelt" wurde (z. B. Lambda-Virus). Man muss hierbei seine DNA auf die Virus-DNA bringen und ist hierbei gezwungen sich ein bisschen auf die Gegebenheiten des Virus einzulassen, was komplizierter ist. Die Plasmide/Vektoren sind sehr groß, dafür ist der Weg ins Bakterium sehr effektiv.
Der zweite Weg ist der chemische oder physikalische (Elektroschock) - ist in jedem Fall ineffektiver, aber dafür einfacher, direkter und ohne Vehikel also besser fürs Labor geeignet.
Die Chemikalie, die man oft nimmt ist Calciumsulfat, (mit zahlreichen Abwandlungen).
>das geschieht nicht auf künstlichem Weg?
Tja was ist denn künstlich? Die Transposons sind von der Natur "entwickelt" worden (wie üblich durch Selektion) und man missbraucht jetzt diese Technik für gentechnische Zwecke. Diese Sequenzen verursachen selbständig, dass die DNA ins Genom überführt wird.
>durch Transfektion, Transformation oder Transduktion gelangt Gen in Pflanzenzelle
Eine Pflanzenzelle ist ein Eukaryont und deshalb muss man sie "transfizieren" (Transfektion), ein Bakterium (Prokaryont) wird transformiert. Transduktion kenne ich eher von SIGNALtransduktion, die Weiterleitung von Signalen.
> wird bei allen Methoden mit dem Plasmid weitergearbeitet?
Die ringförmigen DNA-Plasmide (=Vektoren) sind die geschickteste Art DNA stabil zu "halten", zu vermehren, für die Gentechnik bereitzustellen. Es gibt jedoch auch hin und wieder strangförmige DNA oder auch RNA und manchmal werden auch Einzelstränge benötigt, ebenfalls DNA sowie RNA. Aber fast immer braucht man zuerst ein Plasmid mit dem Zielgen.
Auch in Pflanzenzellen wird (glaube ich) überwiegend mit Plasmiden gearbeitet.
| | Dora | 2009-06-15 19:57:31 |
Profil
Beitrag #7 • | Danke für deine geduldigen Antworten. Es hat mir sehr geholfen die Zusammenhänge zu erkennen und ein wenig mehr Struktur zu bekommen.
War mit der Transduktion etwas verwirrt. Glaube das ist nur zwischen Bakterien möglich.
Danke! | | acribio | 2009-06-15 21:47:41 |
Profil
Beitrag #8 • | Richtig!
Transduktion gibts da und Konjugation.
Über sogenannte Sex-Pili
freut mich, wenn ich helfen konnte | | Beiträge 1 bis 8 von 8 angezeigt. |
