Plasmid pET28 a (+) |
| Oli | 2009-01-29 09:40:32 |
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Beitrag #1 • | Moin, Moin,
ich hoffe hier gibt es ein paar schlaue Köpfe, die mir weiterhelfen können. Ich möchte ein größeres Fragment umklonieren. Dafür werde ich die Restriktionsenzyme Dra III und HindIII verwenden.
Im Zielvektor pET 28 a(+) gibt es natürlich beide Schnittstellen. Allerdings befindet sich die DraIII Stelle nicht im Polylinker, sondern im ori f1. Meine Frage also: Da ich mit E.coli arbeite sollte das herausschneiden des ori f1 doch keine Auswirkung auf die Expression des Gens habe oder? Da es ja noch den ursprünglichen ori BR322 im plasmid gibt?
Welche Auswirkung hat es, wenn das Zielgen in komplementärer Richtung zum ori inseriert wird?
Mfg Oli | | acribio | 2009-01-29 18:24:15 |
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Beitrag #2 • | Hallo,
Ich denke du hast recht (ohne Garantie). Das F1 ori Gen ist zur Herstellung von Einzelsträngiger DNA gedacht. Damit hat man früher viel gearbeitet. Ich glaub, da hat man die einzelsträngige DNA direkt in Lösungen gegeben, in denen ein intakter Proteinexpressionsapparat vorhanden ist, also Ribosomen, beladene tRNA's etc. Wurde glaub ich auch zur RNA-Synthese und zur Herstellung von Phagenbanken verwendet. Das ursprüngliche ori Gen im BR322 plasmid reicht zur Replikation des Vektors.
vergleiche hier:
http://www.biology-online.org/biology-forum/about11546.html
Eine Klonierung mit zwei verschiedenen Schnittstellen sollte den Vorteil haben, dass das Insert gleich richtig herum liegt. Meine Feststellung war jedoch, dass so eine Doppelenzym-Klonierung erheblich schwieriger ist, als wenn man nur ein Enzym hat und dann halt ein paar Klone mit falscher Orientierung aussortieren muss....
Kurz: Würde parallel auch eine Klonierung mit nur einem Enzym andenken...
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