Genanalyse von Null an |
| Anneke | 2008-05-23 10:22:34 |
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Beitrag #1 • | Ich habe nächste Woche meine Diplomprüfung und der Prüfer stellt oft Fragen zu Methoden. Daher meine Frage: Wie untersuche ich ein Gen, über das ich noch nichts weiß? In den Büchern steht, dass man eine cDNA-Bank herstellt und die DNA Fragmente mit einer Sonde hybridisieren. Aber um eine Sonde herzustellen muss ich doch zumindest die Aminosäuresequenz oder noch besser die korrekte Nukleotidsequenz kennen!? Oder nimmt man sich, wenn man z.B. eine Helikase untersuchen will, die Sequenz einer Helikase aus einem anderen, ähnlichen Organismus?
Woanders hab ich gelesen, dass man mit einem Transposon eine Mutante erstellen soll und die Sonde dann gegen Sequenzen aus dem Transposon herstelle. Aber woher weiß ich, dass das Transposon in das entsprechende Gen transponiert wird? Das passiert doch zufällig, oder? Hoffe mir kann jemand weiterhelfen | | acribio | 2008-05-23 20:31:13 |
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Beitrag #2 • | Hallo Anneke,
| In den Büchern steht, dass man eine cDNA-Bank herstellt und die DNA Fragmente mit einer Sonde hybridisiert. |
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Das ist richtig.
Zuerst zu deiner Frage: Wie stellt man eine Sonde her?
Eine Antwort hast du selbst gegeben | ...doch zumindest die Aminosäuresequenz oder noch besser die korrekte Nukleotidsequenz kennen |
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Richtig! Wie kann man jetzt die Sequenz ableiten? Eine Möglichkeit wäre, man kann auf eine bestimmte Weise das Protein isolieren (z. B. Zentrifugationen oder Chromatographie) und dann Bruchstücke dieses Proteins (durch verschiedene Spaltreaktionen) sequenzieren (Aminosäure-Analyse). Auf diese Weise kann man in recht aufwändigen Verfahren Oligonukleotide ableiten, die für dieses Peptid codieren. In den "Wobbel"-Positionen kann man auch Gemische von Nukleotiden einsetzen. Mit diesen Oligos kann man mit Glück dann cDNA-Klone aus der Bank identifizieren, die dann nach der Sequenzierung immer mehr von der Sequenz offenbaren.
Wie funktioniert das Verfahren: Eine Ratten cDNA Bank besteht aus Bakterien oder Hefen, von denen jede Zelle einen Vektor/Plasmid oder PhagenDNA enthält, welches ein Genstück von "Ratte" enthält. (Hierfür wird cDNA-Material von einer oder zumeist mehreren Ratten benötigt). Alle zusammen beinhalten das gesamte Genom der Ratte. Die Bakterien werden auf Kulturschalen ausgestrichen (vereinzelt) und kultiviert. Die Bakterienspots werden auf Filter-Folien (Zellulose oder Nylon-Filter) "abgezogen", lysiert und die DNA ans Filterpapier gekoppelt (z. B. UV-Licht). Man hybridisiert jetzt mit einer markierten Sonde (z. B. radioaktiv) diese Filterpapiere, die zur Sonde komplementären cDNA-Klone binden die Sonde und können auf Filmmaterial identifiziert werden.
Heute würde man für die gesamte Sequenz zuerst die Gendatenbanken in Computern durchforsten. Die Chancen Sequenzen zu finden, die noch nicht bekannt sind, sind äusserst gering. Deine zweite Idee war auch richtig. Man kann z. B. mit einer Sonde die vom Gen des zu untersuchende Proteins aus Schwein abgeleitet ist, eine Ratten-cDNA Bank oder eine humane cDNA Bank "screenen" und so die Sequenz aus anderen Spezies identifizieren. Die Homologien reichen oft aus (oft auch nicht :D ).
Gibt es noch andere Möglichkeiten, die cDNA zu identifizieren?
Ja - es gibt z. B. Expressionsbanken, in denen man die Klone zur Expression anregen kann. Wenn man Eigenschaften des Proteins kennt oder vielleicht einen Antikörper gegen das Protein hat, dann kann man den Klon eventuell auch (auf Proteinebene) finden.
| | acribio | 2008-05-23 20:40:06 |
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Beitrag #3 • | Deine zweite Frage versuche ich einmal durch Vermutungen zu klären.
Mit Transposons bin ich nicht ganz so vertraut.
| Woanders hab ich gelesen, dass man mit einem Transposon eine Mutante erstellen soll und die Sonde dann gegen Sequenzen aus dem Transposon herstelle. |
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Okay - Das Transposon baut sich rein zufällig im Genom ein. Wenn ich dann eine Sonde gegen die Sequenz des Transposons nehme, dann kann ich dieses, die Position und hoffentlich die Bereiche um das Transposon herum herausfinden.
| Aber woher weiß ich, dass das Transposon in das entsprechende Gen transponiert wird? |
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Ha! ganz einfach! Wenn Sich das Transposon in das zu untersuchende Gen einschleust, dann ist dieses vermutlich kaputt und somit inaktiviert ;)
Das Verfahren wird vermutlich so ablaufen, dass man die Mutante isoliert, in der das Gen inaktiviert ist, die also einen Phänotyp ohne das zu untersuchende Protein zeigt.
Ich hoffe, das hat dir geholfen
| | Anneke | 2008-05-23 21:18:02 |
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Beitrag #4 • | Danke erstmal für die Antwort :)
Der Weg den du beschrieben hast, ist in etwa der, den ich in etwa gelernt habe und ich denke auch, dass mein Prof mit so einer Antwort zufrieden wäre. Ich glaube ich denke einfach zu kompliziert dabei. Ich habe mir die Frage gestellt, wie man vorgeht, wenn man wirklich noch NICHTS weiß, wie es in den Anfängen der Gentechnik war. Sprich, man hat einen Phänotyp, z.B. eine Pflanze, und möchte nun etwas über das Gen/Protein erfahren, das für eine bestimmte Merkmalsausprägung verantwortlich ist, z.B. die Blütenfarbe (ganz abgesehen davon, dass ja meistens mehrere Gene für ein Merkmal verantwortlich sind). Da weiß man ja vorher nicht, welches Protein es ist geschweige den welches Gen. Na ja, wahrscheinlich muss man über lange Verfahren erstmal Proteine isolieren und mit diesen verschiedene Tests durchlaufen. Und kann davon ausgehend dann auf das Gen schließen. Verstehst du was ich meine? Wenn ich noch keine Infos über das Protein habe kann ich es ja auch nicht mal eben über Chromatographische Verfahren isolieren. Na ja, wenn der Prof sowas wissen will stelle ich ihm einfach ein paar Gegenfragen :D
| | acribio | 2008-05-23 21:39:44 |
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Beitrag #5 • | | wenn man wirklich noch NICHTS weiß, wie es in den Anfängen der Gentechnik war |
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Naja - BEVOR es die Gentechnik gab wusste man schon UNHEIMLICH viel! Über sehr viele Proteine eben. Man hat sich den ganzen lieben langen Tag damit beschäftigt, Proteine in reiner Form zu erhalten und diese zu vermessen. Ultrazentrifugation, Zentrifugation, Chromatographie, Enzym-Kinetik Messung, Bestimmung von Bindungskonstanten, Co-Faktoren.
Als die Gentechnik dann aufkam, kannte man bereits tausende Proteine, die man alle in der Sequenz bestimmen muste.
Ich bin kein Pflanzengentechniker, aber das ist doch ideal durch Mutation zu ermitteln, meinetwegen auch durch deine Transposons (vermutlich Pflanzenviren). Die Pflanzen, deren Phänotyp die Mutation zeigt, ist dann sichtbar. Bei Tieren: Knock-Out Mäuse z. B.
| Na ja, wenn der Prof sowas wissen will stelle ich ihm einfach ein paar Gegenfragen :D |
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- genau! ;)
Viel Glück bei deiner Prüfung! - Wird schon schiefgehen ;) | | acribio | 2008-05-24 11:27:30 |
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Beitrag #6 • | Als die Gentechnik dann aufkam, kannte man auch bereits Sequenzen von vielen Proteinen, die man in aufwändiger Weise in Aminosäure-Analysen bestimmt hatte.
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